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«Institut für Wasserchemie und Chemische Balneologie Lehrstuhl für Analytische Chemie Entwicklung immunanalytischer Methoden zur Detektion von ...»

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TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

Institut für Wasserchemie und Chemische Balneologie

Lehrstuhl für Analytische Chemie

Entwicklung immunanalytischer Methoden zur Detektion von

niedermolekularen toxischen Verbindungen in Lebensmitteln

Xaver York Zacharias Karsunke

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität

München zur Erlangung des akademischen Grads eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Michael Schuster Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. Reinhard Nießner

2. Univ.-Prof. Dr. Michael Groll Die Dissertation wurde am 31. Mai 2011 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 30. Juni 2011 angenommen.

Danksagung Diese Arbeit entstand in der Zeit vom November 2008 bis Mai 2011 am Lehrstuhl für Analytische Chemie der Technischen Universität München unter der Leitung von Herrn Univ.-Prof. Dr. Reinhard Nießner. Ein Teil der Arbeit wurde durch ein Projekt des BMBF (02WU0969) gefördert.

Mein Dank gilt zunächst Herrn Prof. Dr. Reinhard Nießner für die Möglichkeit die äußerst interessanten Projekte in sehr gut ausgestatteten Laboratorien durchführen zu können.

Besonders möchte ich mich für das Vertrauen und den geschätzten Freiraum in der Forschung bedanken.

Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dietmar Knopp für seine intensive Betreuung während der gesamten Doktorarbeit. Für sein Vertrauen und die Möglichkeit Forschungsaufenthalte sowohl an der TsingHua Universität in Peking (China), als auch an der University of Guelph (Kanada) wahrnehmen zu können, bedanke ich mich herzlich.

Sehr herzlich danke ich Prof. Chris Hall, Dr. Mike McLean und Dr. HaiFeng Wang der Universität Guelph in Kanada für die großartige Unterstützung bei der Herstellung rekombinanter Antikörper. Besonderer Dank gilt hierbei Herrn HaiFeng Wang, der mir auch privat bei meinem Aufenthalt in Guelph eine große Unterstützung war.

Herrn Prof. Boos und Herrn Prof. J.-M. Lin danke ich vielmals für die Möglichkeit der Teilnahme an der „Sino-German Cooperation Research Group for Separation and Analysis of Complex Samples“ und meinem damit verbundenem Forschungsaufenthalt an der TsingHua Universität (Peking, China).

Dr. Ekkehard Weber und Rita Medek vom Institut für Physiologische Chemie der MartinLuther-Universität Halle-Wittenberg danke ich sehr für die Produktion und Reinigung der monoklonalen Antikörper.

Bei Herrn Helmut Krause vom Lehrstuhl für Biochemie der Technischen Universität München bedanke ich mich für die zahlreichen Aufnahmen von MALDI-Spektren. Herrn Dr.

Stefan Asam vom Lehrstuhl für Lebensmittelchemie der Technischen Universität München danke ich für die Bereitstellung zahlreicher Lebensmittelproben.

Besonders bedanken möchte ich mich auch bei meinem Vater für seine Unterstützung und die Entwicklung der Mikroarray-Auswertesoftware SIP 0.4.

Sehr herzlicher Dank gilt meinen Kolleginnen und Kollegen Martin Rieger, Jimena SaucedaFriebe, Susanna Vazac und Michael Pschenitza für ihre große Unterstützung im Labor und die gute Atmosphäre am Arbeitsplatz. Außerdem gilt mein besonderer Dank Ben Greisen, Anna Neumann, Philipp Pust und Josef Schachtner für die Unterstützung im Labor. Für das Korrigieren der Arbeit möchte ich mich besonders bei Sandra Prell, Susanna Vazac und Klaus Wutz bedanken. Des Weiteren danke ich meinen Kollegen und Kolleginnen Anne Wolter, Dr.

Caroline Peskoller, Dr. Christian Cervino, Christine Sternkopf, Dr. Christoph Haisch, Dr.

Clemens Helmbrecht, Gerhard Pappert, Johannes Schmid, Maria Knauer, Dr. Markus Knauer, Mattheo Carrara, Dr. Philipp Stolper, Susanna Mahler, Dr. Thomas Baumann und XiangJiang Liu, sowie allen hier nicht namentlich Erwähnten.

Mein ganz besonderer und liebevoller Dank gilt meiner Mutter, die leider viel zu früh von uns gegangen ist. Meinen Brüdern Ignaz und Franziskus, meiner Tante Anja, meinen Großeltern Elisabeth und Rolf und meiner Verlobten HuiBin Wei danke ich von Herzen für die uneingeschränkte Unterstützung.

Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröffentlicht.

Karsunke X. Y. Z., Pschenitza M., Rieger M., Weber E., Niessner R., Knopp D., Screening and characterization of new monoclonal anti-benzo[a]pyrene antibodies using automated flow-through microarray technology, J. Immunol. Meth. 2011, in press, doi:10.1016/ j.jim.2011.06.016.

Sauceda-Friebe J. C., Karsunke X. Y. Z., Vazac S., Biselli S., Niessner R., Knopp D., Regenerable immuno-biochip for ochratoxin A determination in green coffee extract using an automated microarray chip reader with chemiluminescence detection, Anal. Chim. Acta 2011, 689, 234-242.

Karsunke X. Y. Z., Niessner R., Seidel M., Development of a Multichannel Flow-through Chemiluminescence Microarray for Parallel Calibration and Detection of Pathogenic Bacteria, Anal. Bioanal. Chem. 2009, 395, 1623-1630.

„Wer sich gefangen gibt im Gefängnis seiner Trägheit, ist tot schon vor der Zeit, nutzlos ist sein Tun, sinnlos seine Reden.“ Rudi Benzien Inhaltsverzeichnis I Einleitung und Problemstellung

II Theoretische Grundlagen

1 Getreiderelevante Mykotoxine

1.1 Vorkommen, Bedeutung und Klassifizierung





1.1.1 Aflatoxine

1.1.2 Ochratoxine

1.1.3 Fusarientoxine

1.2 Analytik von Mykotoxinen

1.2.1 Probennahme, -extraktion und -aufreinigung

1.2.2 Trenn- und Detektionsverfahren

1.2.3 Immunanalytische Verfahren

2 Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe

2.1 Vorkommen und Bedeutung

2.2 Analytik von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen..............25 2.2.1 Klassische Trenn- und Detektionsverfahren

2.2.2 Immunanalytische Verfahren

2.2.3 Marktstudie zu kommerziell erhältlichen Testkits

3 Antikörper

3.1 Typen und Strukturen von Antikörpern

3.2 Herstellung poly- und monoklonaler Antikörper

3.3 Herstellung rekombinanter Antikörper

3.4 Charakterisierung von Antikörpern

iIII Ergebnisse und Diskussion

1 Mikroarray für die parallele Detektion von Mykotoxinen

1.1 Herstellung der Mikroarraychips

1.2 Optimierung des Durchflussassays

1.3 Messung von Zearalenon

1.4 Validierung und Messung von Realproben

1.4.1 Kreuzreaktivitäten

1.4.2 Regenerierbarkeit der Mikroarraychips

1.4.3 Durchführung kompetitiver Immunoassays

1.4.4 Messung von Realproben

2 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Benzo[a]pyren

2.1 Synthese von Hapten-Protein-Konjugaten

2.2 Immunisierung, Fusionierung und Zellkulturüberstandsscreening.............71

2.3 Entwicklung eines Chip-basierten Screeningverfahrens

2.4 Sensitivität und Selektivität der monoklonalen Antikörper

2.4.1 Bestimmung der Sensitivität mittels ELISA

2.4.2 Affinitätsbestimmung mit Oberflächenplasmonenresonanz.........79 2.4.3 Bestimmung der Kreuzreaktivitäten

2.4.4 Messung von Realproben

2.5 Entwicklung weiterer Immunoassays

2.5.1 Oberflächenplasmonenresonanz

2.5.2 Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay

2.5.3 Weitere Optimierung des indirekt kompetitiven ELISAs............95 3 Herstellung rekombinanter Antikörper gegen Benzo[a]pyren

3.1 Strategie zur Produktion der scFv-Fragmente

3.2 Herstellung der Vektoren

3.3 Expression und Reinigung der scFv-Fragmente

3.4 Sensitivität und Selektivität der scFv-Fragmente

IV Zusammenfassung und Ausblick

ii V Experimenteller Teil

1 Geräte und Verbrauchsmaterialien

1.1 Geräte

1.2 Software

1.3 Antikörper und Antigene

1.4 Chemikalien und Materialien

1.5 Puffer für ELISA (Mikrotiterplatte)

1.6 Sonstiges

2 Standardprozeduren

2.1 Synthese von Hapten-Peptiden

2.1.1 Synthese von AFB2-CMO

2.1.2 Synthese von ZEA-CMO

2.1.3 Festphasenpeptidsynthese

2.2 Herstellung von Mykotoxin-Mikroarrays

2.3 Qualitative und quantitative Bestimmung von Mykotoxinen am MCR 3.138 2.3.1 Probenvorbereitung und -extraktion

2.3.2 Chemilumineszenzmessungen am MCR 3

2.3.3 Auswertung mit SIP 0.4

2.4 Synthese von Hapten-Protein-Konjugaten

2.5 Immunisierungsprotokoll zur Herstellung monoklonaler Antikörper.......142

2.6 Indirekt nichtkompetitiver ELISA (Screening)

2.7 Direkt nichtkompetitiver ELISA (Screening)

2.8 Indirekt kompetitiver ELISA

2.9 Kreuzreaktivitätstests

2.10 Mikroarray basiertes Zellkulturüberstandsscreening

2.11 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen

2.12 Entwicklung eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays (FPIA).......147

–  –  –

VI Abkürzungsverzeichnis

VII Literaturverzeichnis

iv I Einleitung und Problemstellung I Einleitung und Problemstellung _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Das Bundesamt für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz wirbt mit dem Slogan „Sichere Lebensmittel zu gewährleisten ist eine tägliche Verpflichtung für alle Beteiligten.“ Um dieser Verpflichtung nachzugehen, gibt es in Deutschland und in der Europäischen Union zahlreiche Verordnungen für gesetzliche Höchstmengen von Schadstoffen in Lebensmitteln und ein ausgedehntes Lebensmittelkontrollsystem. Da Lebensmittel in großem Maßstab hergestellt, im- und exportiert und konsumiert werden, müssen robuste und vor allem schnelle Verfahren zur Detektion von chemischen und biologischen Kontaminationen in Lebensmitteln eingesetzt und entwickelt werden.

Hauptsächlich kommen hierbei die validierten chromatographischen Methoden, wie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Gaschromatographie (GC), mit einer Vielzahl von Detektoren zum Einsatz. Ein Nachteil dieser Methoden ist die zeit- und kostenintensive Probenvorbereitung und -reinigung. Alternativ können immunologische Verfahren zum schnellen Screening von Lebensmitteln zum Einsatz kommen, die auf eine Probenaufreinigung verzichten. Immunologische Methoden sind häufig weniger genau, dafür aber schneller und einfacher durchzuführen als chromatographische.

Ziel dieser Arbeit war es, schnelle immunanalytische Verfahren zur Detektion von Mykotoxinen in Getreide und von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAKs) in Trinkwasser zu entwickeln. Bei der qualitativen und quantitativen Bestimmung von Mykotoxinen stand die Methodenentwicklung im Vordergrund, bei der Detektion von PAKs in Trinkwasser lag der Schwerpunkt auf der Entwicklung neuer hoch affiner Antikörper.

Mykotoxine sind sekundäre Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen, die u. a. Reis, Kaffee, Wein, ölhaltige Samen und Getreide befallen. Sie zeichnen sich nicht nur durch ihre akute Toxizität aus, sondern sind meist auch mutagen und kanzerogen. Schimmelpilze können Feldfrüchte schon auf dem Feld oder später bei der Lagerung befallen. Im Fall von Getreide ist der erste Verarbeitungsschritt nach der Ernte meist das Mahlen. Der Müller muss beim Ankauf des Getreides schnell und zuverlässig entscheiden können, ob das Getreide durch Mykotoxine kontaminiert ist. In der Europäischen Union und in Deutschland liegen für acht Mykotoxine bzw. Mykotoxinklassen gesetzlich vorgeschriebene Höchstmengen vor. Die Grenzwerte für die Aflatoxine und Ochratoxin A liegen im unteren g/kg-Bereich, sind damit besonders streng und stellen eine hohe Anforderung an die Entwicklung einer Methode zum Nachweis solch geringer Kontaminationen dar. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der immunanalytischen Detektion von Aflatoxinen, Ochratoxin A und Zearalenon in Getreide

I EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

und Getreideprodukten. Die qualitative und quantitative Analyse soll mittels Chemilumineszenz-Durchfluss-Mikroarray durchgeführt werden. Als Ausleseplattform für den Mikroarray soll der am Institut für Wasserchemie entwickelte Munich Chip Reader 3 (MCR 3) dienen. Diese Problemstellung schließt die Synthese und Charakterisierung von geeigneten Mykotoxinderivaten, die Chipherstellung, die Assayoptimierung, sowie die Validierung der neuen Methode und die Messung von Realproben ein.

Die zweite Aufgabenstellung bestand in der Entwicklung immunanalytischer Methoden zur Detektion von PAKs im Trinkwasser. PAKs kommen ubiquitär in der Umwelt vor, sind toxikologisch sehr bedenklich und werden daher als prioritäre Umweltschadstoffe angesehen.



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