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«genehmigte Dissertation von Dipl.‐Biol. Stefanie Heil aus Dieburg Referent: Prof. Dr. Harald Kolmar Korreferent: Prof. Dr. Felicitas Pfeifer Tag ...»

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Evolutive Optimierung

mikrobieller Lipasen und Esterasen

in Hinblick auf

Substratspezifität und Enantioselektivität

Vom Fachbereich Chemie

der Technischen Universität Darmstadt

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

genehmigte

Dissertation

von

Dipl.‐Biol. Stefanie Heil

aus Dieburg

Referent: Prof. Dr. Harald Kolmar

Korreferent: Prof. Dr. Felicitas Pfeifer

Tag der Einreichung: 11.07.2012

Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2012 Darmstadt 2012 D17 Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Schwerpunktprogramms 1170 „Directed Evolution to Optimize and Understand Molecular Biocatalysts” gefördert.

Inhalt Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung

1.1 Lipolytische Enzyme

/ Hydrolase Faltung und Mechanismus

1.1.1 1.1.2 Klassifizierung und Eigenschaften bakterieller Lipasen

1.1.3 Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten lipolytischen Enzyme

1.1.3.1 Esterase A aus Pseudomonas aeruginosa

1.1.3.2 Lipase und deren spezifische Foldase bei Pseudomonas aeruginosa

1.1.3.3 Cutinase aus Fusarium solani pisi

1.1.3.4 Lipase A aus Bacillus subtilis

1.2 Protein Engineering

1.2.1 Rationelles Protein Design

1.2.2 Gerichtete Evolution

1.2.2.1 CASTing

1.3 Hochdurchsatzverfahren zur Durchmusterung von EnzymBibliotheken

1.3.1 Genotyp-Phänotypkopplung als Grundlage für Hochdurchsatzverfahren

1.3.1.1 Bakterielle Displaysysteme

1.3.1.1.1 Das Autotransportersystem der Esterase aus Pseudomonas aeruginosa zur Oberflächenpräsentation von lipolytischen Enzymen

1.3.1.2 Hefe-Display

1.3.1.3 Phage-Display

1.3.2 Durchmusterung von Enzym-Bibliotheken mit zellbasierter Durchflusszytometrie

–  –  –

1.3.2.1 Kovalente Kopplung der Enzymaktivität auf der Zelloberfläche: Das ESCAPED-Verfahren

1.4 Protein Engineering der Enantioselektivität bei Lipasen

1.5 Zielsetzung

2 Materialien

2.1 Bakterienstämme, Hefestämme, Oligonukleotide und Plasmide

2.2 Molekulare Marker für Gelelektrophoresen

2.3 Enzyme und Proteine

2.4 Chemikalien

2.5 Sonstige Materialien und Geräte

2.6 Nährmedien zur Anzucht

2.6.1 Nährmedien zur Anzucht von E. coli

2.6.2 Nährmedien zur Anzucht von S. cerevisiae

2.7 Lösungen und Puffer

3 Methoden

3.1 Handhabung von Mikroorganismen

3.1.1 Lagerung und Vermehrung von Mikroorganismen

3.1.1.1 Lagerung von E. coli Stämmen

3.1.1.2 Anzucht von E. coli Stämmen

3.1.1.3 Lagerung von S. cerevisiae EBY100

3.1.1.4 Anzucht von S. cerevisiae EBY100

3.1.2 Bestimmung der Zelldichte

3.1.3 Transformation durch Elektroporation

3.1.3.1 Erstellung von kompetenten Zellen und Transformation von E. coli

3.1.3.2 Erstellung von kompetenten Zellen und Transformation von S. cerevisiae EBY100

II Inhalt 3.2 Molekularbiologische Arbeitsmethoden

3.2.1 Vorbereitung von Geräten und Lösungen

3.2.2 Methoden zur Präparation und Analyse von DNA

3.2.2.1 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli

3.2.2.2 Isolation von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae

3.2.2.3 Reinigung von DNA in wässriger Lösung durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln

3.2.2.4 Alkoholische Präzipitation von DNA

3.2.2.5 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA

3.2.2.6 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten zu Analyse und Reinigung

3.2.2.7 Separation von DNA-Fragmenten mittels Sucrosedichtegradienten-zentrifugation

3.2.3 Spaltung von DNA mittels Restriktionsendonukleasen

3.2.4 Ligation von DNA-Fragmenten

3.2.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

3.2.5.1 SOE-PCR (splicing by overlap extension)

3.2.5.2 Kolonie PCR

3.2.6 Sequenzierung

3.3 Proteinchemische Arbeitsmethoden

3.3.1 Isolierung von rekombinant hergestellten Proteinen und Proteinreinigung

3.3.1.1 Herstellung von Zellextrakten

3.3.1.2 Isolierung von Einschlusskörpern (inclusion bodies)

3.3.1.3 Isolierung von Membranproteinen

3.3.1.4 Säulenchromatographische Methoden

Affinitätschromatographie über Ni2+ Chelating Sepharose

3.3.1.4.1 3.3.1.4.2 Dialyse von Proteinen

3.3.2 Elektrophoretische Methoden zur Auftrennung von Proteinen.............. 59 3.3.2.1 Analyse von Proteinen mittels SDSPolyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)

III Inhalt 3.3.2.2 Anfärben der Proteine nach der Elektrophorese mittels Coomassie Brilliantblau

3.3.3 Konzentrationbestimmung von Proteinen

3.3.4 Immunologischer Nachweis von Proteinen

3.3.5 Chemische Modifikation von Proteinen

3.3.5.1 Oxidation und Reinigung von Meerrettich-Peroxidase

3.3.5.2 Biotinylieren von Proteinen

3.3.6 Enzymatische Aktivitätstest

3.3.6.1 Herstellen von Tributyrinplatten

3.3.6.1.1 Tributyrinplatten für E. coli

3.3.6.1.2 Tributyrinplatten für S. cerevisiae EBY100

3.3.6.2 Bestimmung von lipolytischer Aktivität

3.4 Zellbiologische Arbeitsmethoden

3.4.1 Induktion plasmidkodierter Genexpression in E. coli





3.4.2 Induktion plasmidkodierter Genexpression in S. cerevisiae

3.4.3 Immunfluoreszenzmakierung von Mikroorganismen

3.4.3.1 Immunfluoreszenzmakierung von E. coli

3.4.3.2 Immunfluoreszenzmakierung von S. cerevisiae

3.4.4 Fluoreszenzmakierung von Mikroorganismen

3.4.4.1 Fluoreszenzmakierung von E. coli mit Tyramidestern

3.4.4.2 Fluoreszenzmakierung von S. cerevisiae mit Tyramidestern.................. 68 3.4.5 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen von markierten S. cerevisiae

3.4.6 Durchflusszytometrie und Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

3.5 Phage-Display Methoden

3.5.1 Phagen Selektionen

3.5.2 Amplifikation monoklonaler Phagen und Phagenpools

3.5.3 Amplifikation von Helferphagen

3.5.4 Phage-ELISA

–  –  –

4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 E. coli- basierte Oberflächenpräsentation von Proteinen

4.1.1 Untersuchungen der Lipase A aus P. aeruginosa und deren zugehöriger Foldase LipH

4.1.1.1 Expression der Lipase A und der Foldase aus P. aeruginosa

4.1.2 Oberflächendisplay der Lipase A und der Foldase H auf E. coli............. 77 4.1.2.1 Oberflächendisplay der Lipase A

4.1.2.2 Funktionelle Analyse der oberflächenexponierten Lipase A

4.1.2.3 Untersuchung der Bindung zwischen Foldase und Lipase

4.1.2.3.1 Untersuchung der Bindung zwischen LipH und der Lipase mittels Bio-Layer Interferometry (BLI)

4.1.2.3.2 Untersuchung der Bindung zwischen LipH und der Lipase mittels Durchflusszytometrie

4.1.2.3.3 Untersuchung der Aktivität von oberflächenpräsentiertem LipA mittels ESCAPED-Verfahren

4.1.2.3.4 Exkurs: Selektion eines spezifischen cameloiden Antikörpers gegen die Foldase

4.1.3 Oberflächendisplay der Cutinase aus F. solani pisi auf der Oberfläche von E. coli

4.1.3.1 Untersuchung der Überlebensrate und deren Optimierung nach Zellsortierung

4.1.3.2 CASTing und erstellen der CAST-Bibliothek

4.1.3.2.1 Charakterisierung der einzelnen Unterbibliotheken

4.1.3.2.2 FACS-Analysen der einzelnen Bibliotheken

4.1.3.2.3 Durchmusterung der Bibliotheken

4.1.4 Zusammenfassung und Diskussion zur Zelloberflächenpräsentation auf E. coli

4.1.4.1 E. coli Oberflächenpräsentation der Lipase A aus P. aeruginosa........... 108 4.1.4.2 E. coli Oberflächenpräsentation der Cutinase aus F. solani pisi............ 109 V Inhalt 4.2 Aufbau und Untersuchung eines allgemeinen Verfahrens zur Präsentation lipolytischer Enzyme auf der Oberfläche von Hefe

4.2.1 Klonierung lipolytischer Enzyme zur Oberflächenpräsentation auf Hefen

4.2.2 Untersuchung der funktionalen Expression der erzeugten Aga2p-Fusionsproteine

4.2.3 Sequenzierung der lipolytischen Enzyme zur Oberflächenpräsentation auf Hefen

4.2.4 Untersuchung der Oberflächenexposition der erzeugten Aga2Fusionsproteine

4.2.5 Untersuchung der esterolytischen Aktivität der erzeugten Aga2p-Fusionsproteine

4.2.6 Übertragung des ESCAPED-Verfahrens auf Hefezellen

4.2.6.1 Einfluss der Färbung auf Zellen und Bestimmung der Überlebensrate

4.2.6.2 Nachweis einer erfolgreichen Selektion von aktiven Enzymvarianten durch ein Mischungsexperiment

4.2.7 Zusammenfassung und Diskussion zur Zelloberflächenpräsentation auf Hefe

Oberflächenpräsentation der Lipase A aus P. aeruginosa auf 4.2.7.1 S. cerevisiae

4.2.7.2 S. cerevisiae Oberflächenpräsentation der Cutinase aus F.

solani pisi

4.2.7.3 S. cerevisiae Oberflächenpräsentation der Lipase aus B. subtilis........... 124

–  –  –

5 Literatur

6 Anhang

6.1 Übersicht der randomisierten Positionen bei der Cutinase CAST-Bibliotheken

6.1.1 Übersicht der randomisierten Positionen in der Nukleotidsequenz

6.1.2 Proteinsequenzen

6.2 Übersicht FACS-basierter Hochdurchsatzverfahren auf E. coli............. 141

6.3 Abkürzungsverzeichnis

6.4 Danksagung

6.5 Lebenslauf

6.6 Eidesstattliche Erklärung

–  –  –

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Durch lipolytische Enzyme katalysierte Reaktionen

Abbildung 2: α/β-hydrolase fold von Lipasen

Abbildung 3: Mechanismus der katalytischen Triade von lipolytischen Enzymen

Abbildung 4: Faltung und Sekretion der Lipase A aus Pseudomonas aeruginosa

Abbildung 5: Schematische Darstellung von der Durchmusterung von Protein-Bibliotheken

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Oberflächenpräsentation von Proteinen auf E. coli

Abbildung 7: Schematische Darstellung der Oberflächenpräsentation von Proteinen auf Saccharomyces cerevisiae

Abbildung 8: Schematische Darstellung der Selektion von Bibliotheken über Phage-Display

Abbildung 9: Strategien zur Kopplung der Enzymaktivität für die Analyse mittels FACS

Abbildung 10: Schematische Darstellung der Biotin-Tyramid-Reaktion

Abbildung 11: Überblick über die Optimierung der Lipase aus Pseudomonas aeruginosa. (modifiziert nach Reetz et al.

2007)

Abbildung 12: SDS-PAGE nach Überexpression der Lipase A (B) und der Foldase (A) in E. coli Origami(DE3) pLys unter Kontrolle des T7-Promotors in dYT-Medium

Abbildung 13: Photometrischer Aktivitätstest von löslichem LipA (Lipase) und LipH (Foldase).

Abbildung 14: Konstrukte zur Oberflächenpräsentation der Lipase A

Abbildung 15: FACS-Analyse der Oberflächenpräsentation von LipA in verschiedenen E. coli Stämmen

Abbildung 16: Western Blot-Analyse der LipA-EstA-Fusion

VIII Inhalt Abbildung 17: FACS-Analyse der oberflächenexponierten LipA-H Fusion................ 81 Abbildung 18: Photometrische Bestimmung der Aktivität der oberflächenexponierten Lipase (LipA) durch Endpunkt-bestimmungen nach 15, 45 und 120 Minuten

Abbildung 19: Sensogramm der Bindung zwischen LipH und LipA

Abbildung 20: Untersuchung der Bindung von LipH an oberflächenexponiertes LipA durch Immunofärbung (LipHAntikörper) und Analyse der Proben mittels FACS-Analyse.............. 86 Abbildung 21: Zwei-Farben Markierungen von LipA präsentierenden E. coli Zellen mit und ohne Zugabe der Foldase LipH

Abbildung 22: Phage-ELISA-Analyse von zehn potentiellen LipH Bindern............... 90 Abbildung 23: Sequenzen der über Phage-Display selektierten LipHbindenden VHH-Antikörper

Abbildung 24: SDS-PAGE nach Überexpression von VHH-LipH3AP (A) und VHH-LipH8AP (B) in E. coli JM109(DE3) pEZ-tet-SupE............. 92 Abbildung 25: Dot Blot-Analyse der Bindung von VHHLipH8AP an LipH................. 92 Abbildung 26: Sensogramm der Bindung zwischen VHHLipH8 und LipH................ 93 Abbildung 27: Kristallstruktur der Cutinase aus Fusarium solani pisi

Abbildung 28: Restriktionsanalysen der Cutinase CAST-Bibliotheken

Abbildung 29: Sequenzen für je drei Einzelklone der einzelnen Unterbibliotheken A,B,C und D

Abbildung 30: Untersuchung der Expression der Cutinase Bibliotheken mittels FACS-Analyse

Abbildung 31: Untersuchung der lipolytischen Aktivität der Cutinase Bibliotheken

Abbildung 32: Untersuchung aktiver Einzelklone aus den verschiedenen Unterbibliotheken der CAST-Bibliothek

Abbildung 33: Funktionale Analyse der Aga2p-Fusionsproteine mittels Tributyrin-Festmedium

Abbildung 34: FACS-Analyse der auf Hefezellen exponierten lipolytischen Enzyme (Cutinase und B. subtilis Lipase)

IX Inhalt Abbildung 35: Mikroskopische Analyse der Oberflächenpräsentation und der Aktivität der Cutinase und Bacillus subtilis Lipase

Abbildung 36: Photometrische Bestimmung der Aktivität der auf Hefe exponierten Enzyme

Abbildung 37: Analyse der Aktivitätsmessung auf der Zelloberflächen mittels Mikroskopie

Abbildung 38: Aktivitätsmessung der oberflächenexponierten, lipolytischen Enzyme mittels FACS-Analyse

Abbildung 39: Mischungsexperiment: Sortierung eines Gemisches aus lipolytisch aktiven und inaktiven oberflächen-präsentierenden Hefezellen nach oberflächen gekoppelter Aktivitätsfärbung

X Inhalt Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Subfamilien der Familie „wahren Lipasen“ (modifiziert nach Arpigny und Jaeger 1999)

Tabelle 2: Anzahl der möglichen Varianten eines Proteins, in Abhängigkeit der Mutationen (M)

Tabelle 3: Für E. coli beschriebene Oberflächensysteme zur Präsentation von Proteinen (modifiziert nach Rutherford und Mourez 2006 und Lee et al. 2003).

Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Bakterienstämme und Hefestämme

Tabelle 5: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide

Tabelle 6: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide

Tabelle 7: Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels für die Gelelektrophorese.

Tabelle 8: Verwendete Nitrophenyl-Substrate mit zugehörigen Lösemitteln.

Tabelle 9: Übersicht der verwendeten Antikörper für die Immundetektion oberflächenpräsentierter Proteine auf E. coli.............. 66 Tabelle 10: Kinetik und Affinität der VHH-Antikörper gegen LipH mittels SPR-Analyse



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