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«Von der Fakultät Chemie der Universität Stuttgart zur Erlangung der Würde einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte ...»

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DIE HUMANE ACETYLCHOLINESTERASE:

DESIGN UND SYNTHESE EINES OPTIMIERTEN GENS

UND DIE EXPRESSION IN PICHIA PASTORIS

Von der Fakultät Chemie der Universität Stuttgart

zur Erlangung der Würde einer

Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung

vorgelegt von

Sandra Vorlová

aus Hechingen

Hauptberichter: Prof. Dr. Rolf D. Schmid Mitberichter: Prof. Dr. Dieter H. Wolf Prüfungsvorsitzender: Prof. Dr. Wolfgang Kaim Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2002

INSTITUT FÜR TECHNISCHE BIOCHEMIE DER UNIVERSITÄT STUTTGART

Lieber ein Ei brüten als einen Brei hüten Eugène Ionesco La cantatrice chauve

DANKSAGUNG

DANKSAGUNG

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Rolf D. Schmid für die interessante Themenstellung, die Möglichkeit, selbstständig unter hervorragenden Bedingungen zu arbeiten, sowie für seine freudige Diskussionsbereitschaft bei fachlichen und darüber hinausgehenden Fragen. Ganz besonders möchte ich mich für die interessanten und höchst abenteuerlichen Reisen zu den Projektbesprechungen des EU-Projekts QLK3-CT-2000-00650 bedanken.

Prof. Dieter H. Wolf und Prof. Wolfgang Kaim danke ich für die Begutachtung der Arbeit.

Prof. Jean Massoulié und Dr. Claire Weill danke ich für die herzliche Aufnahme, die anregenden Diskussionen und die Einführung in die Geheimnisse der COS-Zellen an ihrem Institut im Herzen von Paris. In diesem Zusammenhang danke ich der Europäischen Gemeinschaft für die Förderung dieser Arbeit im Rahmen des Projekts QLK3-CT-2000-00650.

Dr. Jutta Schmitt danke ich für die Einführung in die Molekularbiologie, ihr ständig wachsames Auge bei der Literaturrecherche und für viele hilfreiche Fragen und Ideen. Großer Dank auch dafür, dass sie für längere Zeit sicherlich unterhaltsamere Literatur links liegen lies, um diese Arbeit zu korrigieren.

Dr. Markus Enzelberger möchte ich ganz besonders danken, für seine immer von neuem motivierende Kritik und für die zahlreichen spannenden, wissenschaftlichen, philosophischen und besonders, freundschaftlichen Diskussionen.

Bei Volker Nödinger möchte ich mich nicht nur für seine wertvollen Tipps und Tricks und seine immer fröhlich-strenge Hand im Laboralltag bedanken, sondern auch für die zahlreichen, trotz Anstrengung immer freudig verplauderten Laufrunden um die Bärenseen.

Besonderer Dank gilt den tapferen Kämpfern gegen die Tücken der Fermentation, Sven Richter, Hendrik Schewe und Dirk Michel, die mir unermüdlich mit großer Hilfe im Biotechnikum zur Seite standen.

DANKSAGUNG

Bei Dr. Stefan Minning möchte ich mich nicht nur für die Einführung in die Proteinaufreinigung und die Mysterien der Pichia pastoris Kultivierung bedanken, sondern auch für die schönen und entspannenden Tage mit ihm und seiner Frau Sandra in Kopenhagen.

Bei Holger Schulze möchte ich mich für die Einblicke in die Welt der Bioanalytik bedanken.

Bei Rut Bethge, Francesca Blasco, Dr. Vlada Urlacher, Kai Doderer, Markus Fischer, Stefan Gernert, Peter Ölschläger, Dr. Ralf Petri, Dr. Holger Scheib und Dr. Frank Zocher möchte ich mich für unendlich viele nette Unterhaltungen und Diskussionen bei Kaffee und Bier bedanken, und den gemeinsamen, unermüdlichen Kampf gegen die manchmal auch trostlosen Seiten des Wissenschaftlerdaseins.

Christine Klumpp-Klug danke ich für ihre Geduld im Chaos und ihr unschlagbares organisatorisches Talent.

Besonders möchte ich mich bei meiner Mutter Mila bedanken, die mit ihrer Lebensfreude und ihrem unerschütterlichen Optimismus mich immer bei allen Zielen und Ideen unterstützt hat und dadurch sicherlich einen Löwenanteil zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.

Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Freund Erik, der trotz eines häufig gerissenen Geduldsfadens mir immer mit gutem Rat und viel Tat in allen Lebenslagen zur Seite steht. Besonders bedanken möchte ich mich für seine kulinarischen Zaubereien, bei deren Genuss es sich noch lustvoller, auch wissenschaftlich, diskutieren ließ.

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ________________________________________________________12

1.1 ACETYLCHOLINESTERASEN ____________________________________________12 1.1.1 ÜBERSICHT __________________________________________________________________ 12 1.1.2 BIOLOGISCHE FUNKTION VON ACETYLCHOLINESTERASEN ______________________________ 13 1.1.3 MOLEKULARE FORMEN VON ACETYLCHOLINESTERASEN _______________________________ 15 1.1.4 STRUKTUR UND REAKTIONSMECHANISMUS VON ACETYLCHOLINESTERASEN________________ 16 1.1.5 ACHE-INHIBITOREN ___________________________________________________________ 17 1.1.6 ANWENDUNG UND BEDEUTUNG VON ACETYLCHOLINESTERASEN ________________________ 18 1.1.6.1 Anwendung in der Bioanalytik _________________________________________________________19 1.1.6.2 Acetylcholinesterase und die Alzheimer-Krankheit _________________________________________22 1.1.6.3 Acetylcholinesterasen in der organischen Synthese _________________________________________22 1.1.7 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON ACHE _________________________________________ 23





1.2 EXPRESSIONSSYSTEME ________________________________________________26 1.2.1 ALLGEMEINES ________________________________________________________________ 26 1.2.2 REKOMBINANTE PROTEINEXPRESSION IN PICHIA PASTORIS _____________________________ 28

1.3 OPTIMIERUNG VON GENEN_____________________________________________31

1.4 AUFGABENSTELLUNG _________________________________________________34 2 ERGEBNISSE ________________________________________________________35

2.1 DESIGN UND SYNTHESE DES GENS DER HUMANEN ACETYLCHOLINESTERASE

FÜR DIE EXPRESSION IN PICHIA PASTORIS _________________________________35 2.1.1 GEN-DESIGN _________________________________________________________________ 35 2.1.2 SYNTHESE DER GEN-KASSETTEN _________________________________________________ 40 2.1.3 ZUSAMMENFÜGEN DER GEN-KASSETTEN ___________________________________________ 42

2.2 EXPRESSION HUMANER ACETYLCHOLINESTERASE IM SCHÜTTELKOLBENMAßSTAB

2.2.1 KLONIERUNG DES SYNTHETISCHEN GENS POPTHACHE IN PPICZαA UND PGAPZαA UND

TRANSFORMATION IN PICHIA PASTORIS X-33 ________________________________________ 44

2.2.2 ETABLIERUNG EINES AGARPLATTEN-ASSAYS ZUM DIREKTEN SCREENING NACH

ACHE-AKTIVITÄT_____________________________________________________________ 45

2.2.3 EXPRESSION DER KONSTRUKTE PPICα-POPTHACHE UND PGAPα-POPTHACHE IN

PICHIA PASTORIS X-33 _________________________________________________________ 47

2.2.4 VERGLEICH DER SEKRETION AKTIVER HACHE UNTER VERWENDUNG VERSCHIEDENER

SIGNALPEPTIDE _______________________________________________________________ 49 2.2.4.1 Synthese des natürlichen Signalpeptids der hAChE mit optimierter Codon Usage _________________49

INHALTSVERZEICHNIS

Vergleich der Sekretion aktiver hAChE unter Verwendung des hefeeigenen α-Faktor 2.2.4.2 Signalpeptids und des natürlichen Signalpeptids ___________________________________________50

2.2.5 VERGLEICH DER EXPRESSION BEI VERWENDUNG DER PICHIA PASTORIS STÄMME X-33,

GS115 UND SMD1168 _________________________________________________________ 53 2.2.6 OPTIMIERUNG DER KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN ___________________________________ 55 2.2.6.1 Kultivierung bei unterschiedlichen pH-Werten ____________________________________________55 2.2.6.2 Kultivierung im Minimalmedium und komplexen Medium ____________________________________56 2.2.6.3 Kultivierung mit variierenden Fütterungsstrategien ________________________________________57

2.3 UNTERSUCHUNG VON EXPRESSIONSAUSBEUTEN BEI VERWENDUNG CODONOPTIMIERTER GENE DER HUMANEN ACETYLCHOLINESTERASE ________________59

2.3.1 EXPRESSION HUMANER UND DER BUNGARUS ACETYLCHOLINESTERASE IN PICHIA PASTORIS ____ 61

2.3.1.1 Klonierung der Gene PopthAChE, hAChE, BopthAChE, und bAChE in pPICZαA___________________61 2.3.1.2 Transformation der AChE Gen-Konstrukte in P. pastoris X33 _________________________________62 2.3.1.3 Vergleich der Expressionsausbeuten der AChE Gen-Konstrukte in P. pastoris X33 ________________63 2.3.2 EXPRESSION HUMANER UND BUNGARUS ACETYLCHOLINESTERASE IN COS-ZELLEN___________ 65 2.3.2.1 Klonierung des Gens PopthAChE in den Expressionsvektor pcDNA3____________________________65 2.3.2.2 Vergleich der Expressionsausbeuten der AChE Gen-Konstrukte in COS-Zellen ___________________67

2.4 FERMENTATION VON PICHIA PASTORIS ZUR PRODUKTION VON HACHE_________ 68 2.4.1 KULTIVIERUNG MIT GLYCERIN FED-BATCH UND METHANOLZUGABE NACH JEWEILS 24 H _____ 68 2.4.2 KULTIVIERUNG MIT GLYCERIN-METHANOL MISCHFÜTTERUNG __________________________ 69 2.4.3 KULTIVIERUNG MIT AN CO2-GEHALT IN DER ABLUFT GEKOPPELTER METHANOL-____________ 70 2.4.4 KULTIVIERUNG IN KOMPLEXEM MEDIUM MIT UNMITTELBARER INDUKTION_________________ 71

2.5 KLONIERUNG EINES FUSIONSPROTEINS DER HACHE UND EGFP ______________73 2.5.1 FUSION DER GENE POPTHACHE UND EGFP __________________________________________ 73 2.5.2 TRANSFORMATION UND EXPRESSION DES FUSIONSPROTEINS HACHE-EGFP ________________ 75

2.6 AUFREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER HUMANEN ACHE _____________77

2.6.1 REINIGUNG DER IN KOMPLEXEM MEDIUM KULTIVIERTEN HACHE AUS PICHIA PASTORIS

MITTELS AFFINITÄTS-CHROMATOGRAPHIE __________________________________________ 77 2.6.2 CHARAKTERISIERUNG DER HUMANEN ACHE AUS PICHIA PASTORIS _______________________ 79 2.6.2.1 N-terminale Aminosäuresequenz _______________________________________________________79 2.6.2.2 Deglycosylierung der hAChE aus Pichia pastoris __________________________________________79 2.6.2.3 Native PAGE der hAChE mit Aktivitätsfärbung nach Ellman _________________________________80 2.6.2.4 Bestimmung von Hemmkonstanten ki der rekombinanten hAChE ______________________________81 2.6.3 CHARAKTERISIERUNG DER HUMANEN UND BUNGARUS ACHE AUS COS-ZELLEN_____________ 81 2.6.3.1 Native-PAGE der AChE mit Aktivitätsfärbung nach Karnovsky _______________________________81

INHALTSVERZEICHNIS

3 DISKUSSION_________________________________________________________83

3.1 GENSYNTHESE_______________________________________________________84

3.2 KLONIERUNG UND TRANSFORMATION DES OPTIMIERTEN GENS DER HACHE

(POPTHACHE) IN PICHIA PASTORIS _______________________________________85

3.3 VARIANZ DER EXPRESSIONSAUSBEUTEN VERSCHIEDENER TRANSFORMANDEN

UND GLEICHER KLONE ________________________________________________85

3.4 OPTIMIERUNG DER KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN IM SCHÜTTELKOLBENMAßSTAB

3.5 OPTIMIERUNG DER KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN IM FERMENTER____________90

3.6 VERGLEICH CODON-OPTIMIERTER GENE HUMANER ACETYLCHOLINESTERASE

IN IHRER EXPRESSION _________________________________________________91

3.7 CHARAKTERISIERUNG HACHE EXPRIMIERT IN PICHIA PASTORIS ______________93

3.8 KLONIERUNG EINES FUSIONSPROTEINS AUS HACHE UND EGFP ______________94 4 ZUSAMMENFASSUNG________________________________________________95 5 ENGLISCHE ZUSAMMENFASSUNG ___________________________________97 6 MATERIAL UND METHODEN________________________________________105

6.1 VERWENDETE GERÄTE _______________________________________________105

6.2 CHEMIKALIEN UND ENZYME __________________________________________106

6.3 VERWENDETE PLASMIDE _____________________________________________107

6.4 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE _____________________________________108

6.5 MEDIEN, PUFFER UND LÖSUNGEN ______________________________________110 6.5.1 MEDIEN____________________________________________________________________ 110 6.5.1.1 Medien und Medienzusätze für Escherichia coli___________________________________________110 6.5.1.2 Medien und Medienzusätze für Pichia pastoris____________________________________________111 6.5.1.3 Medien und Medienzusätze für COS-Zellen ______________________________________________112 6.5.2 ALLGEMEINE PUFFER UND LÖSUNGEN ____________________________________________ 112

6.6 ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN ____________________________________114 6.6.1 VERWENDETE MIKROORGANISMEN ______________________________________________ 114 6.6.2 KULTIVIERUNG UND TRANSFORMATION DER MIKROORGANISMEN_______________________ 114 6.6.2.1 Kultivierung von Escherichia coli______________________________________________________114 6.6.2.2 Transformation von Escherichia coli durch Hitzeschock ____________________________________115

INHALTSVERZEICHNIS

6.6.2.3 Kultivierung von Pichia pastoris_______________________________________________________115 6.6.2.4 Bestimmung des Phänotyps von transformierten Pichia pastoris ______________________________115 6.6.2.5 Transformation von Pichia pastoris durch Elektroporation __________________________________115 6.6.2.6 Expression rekombinanter AChE in Pichia pastoris ________________________________________116

6.7 ARBEITEN MIT COS-ZELLEN __________________________________________117 6.7.1 COS-ZELLEN _______________________________________________________________ 117 6.7.2 KULTIVIERUNG VON COS-ZELLEN _______________________________________________ 117 6.7.3 TRANSFEKTION VON COS-ZELLEN _______________________________________________ 117 6.7.4 PRÄPARATION VON ZELLLYSATEN _______________________________________________ 118



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