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«Abteilung für Sportorthopädie der! Technischen Universität München! Klinikum rechts der Isar! (Vorstand: Univ.-Prof. Dr. A. Imhoff)! ! ! ! ! ! ...»

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Abteilung für Sportorthopädie der!

Technischen Universität München!

Klinikum rechts der Isar!

(Vorstand: Univ.-Prof. Dr. A. Imhoff)!

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Analyse des BMP2-Einflusses auf die

Knorpelregeneration mittels

quantitativer RT-PCR in vitro

und in vivo

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Jonas Christian François Wilisch!

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Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines!

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Doktors der Medizin!

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genehmigten Dissertation.!

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Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J. Rummeny !

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Prüfer der Dissertation: !

1. Priv.-Doz. Dr. St. W. Vogt !

2. Univ.-Prof. Dr. J. Schlegel!

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Die Dissertation wurde am 16.12.2010 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 23.11.2011 angenommen.!

Meinen Lieben Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung

1.1 Gelenkknorpel

1.1.1 Aufbau und Funktion

1.1.2 Sox9

1.1.3 Cbfa1 resp. Runx2

1.1.4 Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2)

1.2 Knorpelschäden

1.2.1 Ätiologie

1.2.2 Einteilungen

1.3 Regenerationsmöglichkeiten und therapeutische Ansätze..............23 1.3.1 Stammzellrekrutierende Verfahren resp. Mikrofrakturierung

1.3.2 Autologe und Matrix-induzierte Chondrozytenimplantation (ACI/MACI).........25 1.3.3 Knorpel-Knochen-Transplantationen z.B. Osteochondral Autograft Transplantation (OATS)

1.3.4 Ausblick

1.4 Ziele dieser Arbeit

1.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

1.5.1 Die Entwicklung der molekularen DNA-Analytik

1.5.2 Funktionsweise der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

1.5.3 Primerdesign

1.5.4 Quantitative PCR

1.5.5 Real-Time-PCR

1.5.6 Reverse Transkription (RT-PCR)

2 Material und Methodik

2.1 Förderung

2.2 Tierversuche

2.2.1 Begründung

2.2.2 Tierart

2.2.3 Herkunft/Züchtungsort

2.2.4 Tierhaltung

2.2.5 Versuchsgruppen

2.2.6 Operatives Vorgehen

2.3 Zellkultivierung sowie Vektor-Generierung und -Transduktion........58 2.3.1 Generierung des nicht-viralen Vektors und Einschleusung

2.3.2 Generierung des viralen Vektors und Zelltransduktion

2.3.3 Chondrozytenisolierung, Zellkultur und Präparation der Fibrin-Clots.............60

2.4 RNA-Analysen

2.4.1 Gensequenzen

2.4.2 Primer und Sonden

2.4.3 RNA-Isolierung

2.4.4 Reverse Transkription

2.4.5 Quantitative PCR

2.5 Statistische Auswertung

3 Ergebnisse

3.1 Analyse der mit hBMP2-pBullet-transduzierten Chondrozyten.......70 3.1.1 hBMP2-pBullet in vitro – qRT-PCR der Zellkultur

3.1.2 hBMP2-pBullet in vivo – qRT-PCR 12 Wochen nach Implantation................71

3.2 Analyse der mit hBMP2-COPROG transfizierten Chondrozyten.....72 3.2.1 hBMP2-COPROG in vivo – qRT-PCR 12 Wochen nach Implantation..........72 4 Diskussion

5 Zusammenfassung

6 Literaturverzeichnis

7 Abbildungsverzeichnis

8 Danksagung

9 Lebenslauf

10 Veröffentlichungen

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

• % – Prozent

• °C – Grad Celsius

• µg – Mikrogramm

• µl – Mikroliter • 293T-Zellen – HEK (Human Embryonic Kidney)-Zellen welche zusätzlich das SV40-large T-Antigen exprimieren

• ACI – Autologe Chondrozyten-Implantation

• AMV – Avian Myeloblastosis Virus

• AT – Adenin Thymin (komplementäre DNA-Basen)

• BMP2 – Bone Morphogenetic Protein 2 (hBMP2 – humanes BMP2)

• Bp – Basenpaare

• CD – Campomele Dysplasie

• cDNA – komplementäre DNA (nach reverser Transkription von RNA)

• Col – Kollagen, z.B. Col2 für Kollagen Typ 2

• DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium

• DNA – Desoxyribonukleinsäure

• dsDNA – Doppelstrang-DNA

• EDTA – Ethylendiamintetraacetat

• et al. – et altera

• EZM – Extrazelluläre Matrix

• Fam – Reporterfluofor der RNA-Sonden

• GAG-Ketten – Glycosaminoglykanketten

• GC – Guanin Cytosin (komplementäre DNA-Basen)

• HA – Hyaluron-Säure

• hBMP2-COPROG – hBMP2-Copolymer-protected-Gene-Vector

Abkürzungsverzeichnis

• hBMP2-pBullet – viraler hBMP2-Vektor, ein Derivat des MoMLVVektors

• HD – Homeodomain

• HMG-box – High mobility group box

• HSS-score – Hospital for Special Surgery score

• i.v. – intravenös

• ICRS – International Cartilage Repair Society

• Ihh – Indian Hedgehog

• IU – International unit

• kg – Kilogramm

• l – Liter

• LTR – Lange terminale Repetitionen der Virus-RNA

• m – Meter

• m² – Quadratmeter

• MACI – Matrix induzierte autologe Chondrozyten Implantation

• mg – Milligramm

• Mg2+ – Magnesium

• min – Minute





• ml – Milliliter

• mm – Millimeter

• MoMLV – Moloney Murine Leukemia Virus

• mRNA – Messenger Ribonukleinsäure

• MRT – Magnetresonanztomographie

• MSZ – Mesenchymale Stammzelle

• NaCl – Natriumchlorid

• NCBI – National Center for Biotechnology Information

• NFQ – Non-fluorescent Quencher

Abkürzungsverzeichnis

• NZW – Weiße Neuseeländer Kaninchen

• OATS – Osteochondrale Autografttransplantation (Osteochondrales Autologes Transfer-System)

• OD – Osteochondrosis dissecans

• Oligo-dT – Basensequenz aus 15-25-Desoxythymidinen

• PBS – Phosphatgepufferte Salzlösung (englisch phosphate buffered saline)

• PCR – Polymerasekettenreaktion

• pH – pondus Hydrogenii oder potentia Hydrogenii

• PTHrP – parathyreoid related Peptid

• qRT-PCR – quantitative RT-PCR

• RNase – Ribonuklease

• rRNA – ribosomale Ribonukleinsäure

• RT-PCR – PCR mit vorausgegangener reverser Transkription

• s.c. – subcutan

• SCID-X1 – Severe Combined Immunodeficiency

• SEM – Standard Error of the Mean, Standardfehler

• SIN-Vektor – Self inactivating Vector

• Tet-System – Über Tetracyclin regulierbares Vektorsystem

• TGFß – Transforming growth factor ß

• Tm – Schmelztemperatur

• tRNA – Transfer-Ribonukleinsäure

• UV – Ultraviolett

• VSV.G. – Glykoprotein G des Vesicular-Stomatitis-Virus (Hüllprotein)

• ZNS – Zentrales Nervensystem

• ZPF – Zentrum für präklinische Forschung (am Klinikum rechts der Isar)

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1 Einleitung

1.1 Gelenkknorpel 1.1.1 Aufbau und Funktion Der hyaline Gelenkknorpel ist ein avaskuläres und alymphatisches Gewebe.

Er ist nicht innerviert und besitzt keine Basalmembran. Knorpel ist ein zellarmes Gewebe. Die Chondrozyten, welche die Grundsubstanz des Knorpelgewebes bilden und somit die Fähigkeit der mechanischen Dämpfung und des fast reibungslosen Gleitens ermöglichen, werden ausschließlich durch Diffusion ernährt und unterliegen keiner immunologischen Erkennung.

Feingeweblich findet man neben Chondrozyten dessen Extrazelluläre Matrix (EZM). Diese besteht aus Kollagenfasern und Proteoglykanen, wobei der Anteil der Knorpelzellen nur etwa 1–10% der gesamten Knorpelmasse ausmacht. Kollagene sind Tripelhelices-formende Polypeptidketten.

Proteoglykane sind an das Kollagennetzwerk gebunden bzw. mechanisch in ihm gefangen.

Der Hauptanteil des Matrixgerüstes des hyalinen Knorpels besteht aus Kollagen-Typ-II-Fasern (Col2). Im Gegensatz hierzu besteht der Faserknorpel zum Großteil aus Kollagen Typ I (Col1). Daneben findet sich in weit

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viskoelastischen Eigenschaften des hyalinen Knorpels. Für die Elastizität und Resistenz gegen Scherkräfte sind die Kollagenfibrillen verantwortlich. Die Schichtdicke des hyalinen Gelenkknorpels ist je nach Topographie unterschiedlich und kann im Bereich der Patella 7-8 mm erreichen (Fritz, Gaissmaier et al. 2006).

Chondrozyten sind für die Synthese und den Umsatz der EZM des Knorpels verantwortlich. Diese bildet wiederum eine Umgebung, die eine geregelte Ernährung der Chondrozyten und die biomechanischen Fähigkeiten des Knorpels bedingt. Reife, humane Chondrozyten sind meist runde, ca. 13 µm große, in der EZM gelegene Zellen (Lin, Willers et al. 2006). Sie bauen die EZM auf und ab und erhalten so ein Gleichgewicht zwischen der zellulären Umgebung und der Struktur des Knorpelgewebes. Die zwei wichtigsten

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Proteoglykan, welches als Aggrecan bezeichnet wird (Knudson and Knudson 2001; Lin, Willers et al. 2006) (Abbildung 1). Durch die negative Ladung der Proteoglykan-Seitenketten (Glykosaminoglykane wie Chondroitinsulfat) wird Wasser im Knorpelgewebe gebunden und der Widerstand gegen von außen einwirkende Kräfte erhöht. Aggrecanmonomere bestehen aus einem

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zentralen Protein („Core“-Protein) und an dieses kovalent gebundene polyanionische Glykosaminoglykanketten (GAG-Ketten). Die Monomere bilden ein Netzwerk, indem sie sich untereinander über Hyaluronsäure (HA) und andere Proteine verbinden und so die Zwischenräume zwischen den Kollagenfasern ausfüllen (Knudson and Knudson 2001). HA ist ein GAG welches aus β-glykosidisch miteinander verknüpften Glukuronyl-β-NAcetylglukosamin-Disaccharid-einheiten besteht, wobei bis zu 100.000 Einheiten aufeinander folgen können. HA bindet über Bindungsproteine und CD44-Zelloberflächenproteine an Chondrozyten. Über diese hat sie eine wichtige Rolle in der strukturellen Organisation und Funktion des Knorpels, der Zelladhäsion, -migration sowie der -differenzierung (Knudson and Knudson 1993; Lin, Willers et al. 2006).

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Abb. 1 Modifiziert aus Horton, Moran et al. 2008:

Proteoglykane bestehen aus einem Core-Protein und an dieses kovalent gebundene polyanionische Glykosaminoglykanketten (GAG-Ketten). Die Monomere bilden ein Netzwerk, indem sie sich untereinander über Hyaluronsäure und anderen Bindungsproteine verbinden und so die Zwischenräume zwischen den Kollagenfasern ausfüllen.

Chondrozyten stammen von multipotenten mesenchymalen Stammzellen (MSZ) ab. Diese können sich außer in Chondrozyten in weitere Zellen differenzieren, wie Osteoblasten, Fibroblasten, Adipozyten und Myoblasten.

Die Chondrogenese der chondralen Ossifikation startet mit der Kondensation der MSZ, die mit der Expression von Zell-Zell-Adhesionsmolekülen, wie z.B.

N-Cadherin, Col1 sowie HA, verbunden ist. Hierdurch wird die EZM gebildet, die als Anlage der zu bildenden Knochen fungiert (DeLise, Fischer et al.

2000; Stanton, Underhill et al. 2003) (Abbildung 2).

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Mit dem Übergang der Chondrozytenvorläuferzellen zu den Chondroblasten startet die Expression chondrozytenspezifischer Gene wie der des Transkriptionsfaktors Sox9, Col2 und Aggrecans. Diese wird während der Differenzierung in proliferierende/reife Chondrozyten fortgesetzt. Col2 und Sox9 bilden Markerproteine dieser Phase. Mit dem Beginn der Expression von Cbfa1/Runx2 verlassen Chondrozyten den Zellzyklus und wandeln sich über die Phase der prähypertrophen in hypertrophe Chondrozyten um. Diese sind durch ihr großes Zellvolumen und die Expression von Col10 charakterisiert (de Crombrugghe, Lefebvre et al. 2001; DeLise, Fischer et al.

2000; Stanton, Underhill et al. 2003) (Abbildung 3).

Chondrozyten aus Gelenkknorpel sind von mineralisierendem Knorpel aus der chondralen Ossifikation unterscheidbar, auch wenn diese sich aus

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Gelenkknorpel zwar metabolisch aktiv und exprimieren Col2, 6, 9 und 11 sowie Aggrecan, besitzen jedoch keine signifikante Proliferation. Im Gegensatz zum mineralisierenden Knorpel verharrt die Differenzierung der Gelenkchondrozyten im Stadium der reifen Chondrozyten. (Drissi, Zuscik et al. 2005). Eine wichtige Rolle spielt dabei der Wachstumsfaktor Sox9.

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Abb. 2 aus Stanton, Underhill et al. 2003: Schematische Darstellung der Chondrogenese 1.1.2 Sox9 Sox9 gehört zur Familie der Sox-Transkriptionsfaktoren. Diese sind durch eine High-mobility-group-(HMG)-Box-DNA-Bindungsdomäne charakterisiert.

Der Name stammt von der großen Homologie zwischen den HMG-Boxen der Sox-Familie und der des SRY-Faktors ab, welche auch als SRY-Box bekannt ist. Der SRY-Faktor spielt eine Rolle in der Geschlechtsdeterminierung. Sox9

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Aktivierungsdomäne und an eine spezifische Sequenz in einer kleinen Furche der DNA (Wegner 1999).

Sox9 hat zwei bedeutende Rollen in der Chondrogenese. Diese wurden durch die Untersuchung der Campomele-Dysplasie (CD) etabliert, einer genetischen Krankheit, die mit einer eigentümlichen Verbiegung und Verkrümmung der Extremitäten einhergeht. Radiologisch und morphologisch charakteristisch sind eine Abknickung der langen Röhrenknochen mit

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Veränderungen des Säulenknorpels und unreife Chondrozyten. Die Erkrankung ist autosomal-rezessiv vererblich und immer mit anderen Missbildungen kombiniert, die unter Umständen zum Tode führen (Herz- und ZNS-Missbildungen, urogenitale Missbildungen, Gonadendysgenesie). Die Mutation liegt in und um das Sox9-kodierende Gen, wodurch Sox9 während

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Crombrugghe, Lefebvre et al. 2001; Meyer, Sudbeck et al. 1997; Wagner, Wirth et al. 1994). Genetisch manipulierte Mäuse, denen ein Allel des Sox9Gens fehlt, bilden den Phänotyp der CD aus. Es findet sich eine verringerte und verspätete mesenchymale Kondensation, welche zu einer Hypoplasie der enchondralen Knochen führt. Zudem wurde eine Längenzunahme der Zone der hypertrophen Chondrozyten beobachtet, welche mit einer verfrühten

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