WWW.ABSTRACT.XLIBX.INFO
FREE ELECTRONIC LIBRARY - Abstract, dissertation, book
 
<< HOME
CONTACTS



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 17 |

«zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität vorgelegt von Diplom-Biologe ...»

-- [ Page 1 ] --

INAUGURAL DISSERTATION

zur

Erlangung der Doktorwürde

der

Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät

der Ruprecht-Karls-Universität

vorgelegt von

Diplom-Biologe Rolf Stratmann

Tag der mündlichen Prüfung:

Pektin Methylesterasen (PMEs) und PME-Inhibitor (PMEI) –

verwandte Proteine im Maispollen: Genexpression,

subzelluläre Lokalisation und funktionelle Charakterisierung

Gutachter: Prof. Dr. Thomas Rausch Prof. Dr. Rüdiger Hell Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung

2 Einleitung

2.1 Zur Rolle des männlichen Gametophyten in der Reproduktion der Pflanzen

2.2 Pollenschlauchwachstum: Ein besonderer Typ von extremen Spitzenwachstum

2.2.1 Der Pollenschlauch

2.2.2 Steuerung und Regulation des Pollenschlauchwachstums

2.2.2.1 Notwendigkeit einer gerichteten Zellwandsynthese

Calcium Ionen

GTPasen

Aktin

cAMP

Calmodulin CaM

Protonen

Kalium und Chlorid Ionen

Wachse

Flavonoide

2.2.2.2 Genereller Aufbau der Pollenschlauchzellwand in Dikotyledonen und Monokotyledonen

2.2.3 Die Rolle der Pektine und ihres Methylierungsstatus

2.2.3.1 Pektinbiosynthese

2.2.3.2 Biologische Aufgaben von Pektinen

2.2.3.3 Pektin in der Zellwand

2.2.3.4 Signalweiterleitung und Pathogenabwehr durch Oligogalacturonide (OGAs)........ 17 2.2.4 Pektin Methylesterasen

2.2.4.1 Proteinstruktur und Katalysemechanismus von Pektin Methylesterasen.................18 2.2.4.2 Physiologische Funktionen von Pektin Methylesterasen

2.2.4.3 Regulation von Pektin Methylesterasen

2.2.4.4 PME Inhibitoren

2.2.4.5 Die Rolle von PMEs und PMEI-RPs während der Pollenentwicklung:

Der Pollenschlauch als Modellsystem zur Identifizierung von Pektinstoffwechselvorgängen während des gerichteten Spitzenwachstums

3 Zielsetzung

4 Material und Methoden

4.1 Pflanzenmaterial

4.1.1 Anzucht von Zea mays Pflanzen der Sorte „Lixis“

4.1.2 Pollenproben von Nicotiana tobaccum

4.2 Isolation von Zellwandproteinen aus Maispollen bzw. aus aufgeschlossenen Zellen.............26

4.3 Isolation der Zellwandproteine aus Maisblütengeweben zur Auftrennung in einer Gelfiltration

4.4 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen nach Bradford

4.5 Proteinfällungen

4.5.1 Acetonfällung von Proteinen aus einer wässrigen Lösung

4.5.2 Trichloressigsäure-fällung von Proteinen

4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

4.7 Proteinfärbungen

4.7.1 Coomassiefärbung von Gelen

4.7.2 Amidoschwarzfärbung

4.7.3 Ponceaurotfärbung

4.8 Western-Blot Analyse

4.9 Arbeiten mit Escherichia coli

4.9.1 Bakterienmedien

4.9.2 Herstellung einer Glycerin-Bakterienstocklösung

4.9.3 Herstellung elektrokompetenter E. coli-(XL1-Blue)-Zellen

4.9.4 Elektroporation von E. coli

4.9.5 Proteinexpression der vier rekombinanten Pektin-Methylesterase-Inhibitor-verwandtenProteine PMEI-RP1 bis PMEI-RP4 in E. coli

4.9.6 Proteinexpression verschiedener Pektin-Methylesterasen und PME-Fragmente in E. coli

4.10 Arbeiten mit Pichia pastoris

4.10.1 Pichia pastoris Medien

4.10.2 Herstellung von elektrokompetenten Pichia pastoris

4.10.3 Elektroporation von Pichia pastoris

4.10.4 Proteinexpression in Pichia Pastoris

4.11 Affinitätsreinigung von Antiseren

4.12 Lektin Chromatographie

4.13 Größenausschluss-Flüssigkeitschromatographie

4.14 Ballistische Transformation

4.14.1 Funktionsprinzip der 'Particle Gun'

4.14.2 Partikelpräparation

4.14.3 Transformation von Nicotiana tobaccum Pollen

4.14.4 Pollenkeimung

4.14.5 Beschuss der Zellen

4.15 Mikroskopie

4.16 PME Assay

4.16.1 Inhibitionstest für PMEs

4.17 Invertase-Assay

4.18 DNA-Methoden

4.18.1 Isolierung von Plasmid DNA im kleinen Maßstab

4.18.2 Isolierung von Plasmid DNA über Ionenaustauschersäulen

4.18.3 Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzenmaterial

4.18.4 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA (OD-Messung)

4.18.5 DNA-Fällung zur Reinigung und Konzentrierung

4.18.6 Restriktion von DNA

4.18.7 Dephosphorylierung der 5´-Enden von DNA-Fragmenten mit alkalischer Phosphatase

4.18.8 Ligation von DNA Fragmenten

4.18.9 RNA-Reinigung und cDNA Synthese

4.18.10 PCR-Techniken

4.18.11 RLM RACE zur Amplifikation von Volllängen cDNAs

4.18.12 Reinigung von DNA Fragmenten

4.18.13 Sequenzierung von Plasmiden

4.18.14 DNA-Gelelektrophoresen

4.18.14.1 Agarosegele

4.18.14.2 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

4.18.14.3 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

4.19 RNA-Methoden

4.19.1 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von RNA

4.19.2 RNA-Agarosegelelektrophorese

4.20 Vektoren und Oligonucleotide

4.21 Abkürzungen und Internetadressen

5 Ergebnisse

5.1 cDNS-Klonierung von vier in Maispollen exprimierten PME-Isoformen





5.2 Identifizierung und Re-Klonierung von zwei Typ I PMEs aus Mais

5.2.1 Re-Klonierung der pollenspezifischen ZmC5 PME: Sequenzkorrektur

5.2.2 Identifizierung einer neuen Typ I PME aus Zea mays

5.3 Identifizierung und Klonierung von zwei Typ II PMEs aus Mais

5.3.1 Identifizierung einer neuen Typ II PME aus Zea mays Pollen

5.3.1.1 Analyse der erhaltenen PME Aktivitätsbanden

5.3.2 Identifizierung einer weiteren Typ II PME aus Mais

5.4 Versuche zur heterologen Expression der rekombinanten PME-Proteine in verschiedenen Expressionssystemen

5.5 Expressionsmuster der Pektin Methylesterasen PME1 bis PME4 in Zea mays mittels semi-quantitativer RT-PCR

5.6 cDNS-Klonierung von vier in Maispollen exprimierten PMEI-Isoformen

5.7 Entwicklungsabhängige Expression der verschiedenen PMEI-Isoformen

5.8 Sind die nativen PMEI-RPs aus Zea mays glykosiliert?

5.9 Heterologe Expression von vier rekombinanten, in Maispollen exprimierten PMEI-Proteinen

5.10 Indirekter Nachweis von Disulfidbrücken in PMEI-RPs

5.11 Versuche zum Nachweis der Komplexbildung zwischen PME- und PMEI-Proteinen.... 74

5.12 In vitro-Versuche zur Inhibition von PME-Aktivität

5.13 Wirkung von exogener PME-Gabe auf Pollenkeimung und Pollenschlauchwachstum........77

5.14 Subzelluläre Lokalisierung von Mais PME- und PMEI-Proteinen in wachsenden Pollenschläuchen mittels Reporter-Fusionen

5.14.1 Klonierungen von zwei Typ I PMEs und zwei Typ II PMEs aus Zea mays in den Vektor pHD223::RFP

5.14.2 Klonierung von PMEI-RP1 bis PMEI-RP4 aus Zea mays in den Vektor pHD32::YFP

5.14.3 Kotransformation von Tabakpollen mit pHD228::PME2::RFP und den PMEI-RP Vektoren

6 Diskussion

6.1 Identifizierung von Typ I und Typ II PMEs aus Mais

6.2 Transkripte der vier identifizierten Typ I und Typ II PMEs lassen sich in unterschiedlichen Maisgeweben nachweisen

6.3 In Pollenproben kann nur eine PME Aktivitätsbande und nur eine Typ II PME nachgewiesen werden

6.4 Die klonierten PMEs lassen sich weder in den verwendeten bakteriellen Systemen noch im eukaryontischen Pichia pastoris System zur Expression bringen

6.5 Die Typ I PMEs besitzen eine Invertase- und PME-Inhibitoren homologe N-terminale ProDomäne

6.6 Mit Mais PMEI-RPs lassen sich weder Invertase- noch Pektin Methylesterase-Aktivitäten inhibieren

6.7 Es konnten keine Interaktions/Bindepartner der vier PMEI-RPs nachgewiesen werden........ 99

6.8 PMEI-RP1 und PMEI-RP3 werden in die Zellwand sekretiert und lokalisieren an der Pollenschlauchspitze

6.9 PMEI-RP2 lokalisiert im heterologen Tabakpollensystem im sekretorischen Weg, lässt sich aber nicht in der Zellwand bzw. an der Pollenschlauchspitze nachweisen

6.10 Das Typ II PME Fusionsprotein PME2::RFP lässt sich in der Zellwand und im Pollenschlauch als diffuses Signal nachweisen

6.11 Ausblicke

7 Literaturverzeichnis

8 Danksagung

1. Zusammenfassung

1 Zusammenfassung Pektin Methylesterasen (PMEs) und Pektin Methylesterase Inhibitor verwandte Proteine (PMEI-RPs) im Maispollen: Genexpression, subzelluläre Lokalisation und funktionelle Charakterisierung Während der Pollenentwicklung und dem Pollenschlauchwachstum spielen dynamische Veränderungen der Pektinzusammensetzung in der Zellwand eine entscheidende Rolle. Besonders die durch Pektin Methylesterasen vermittelte Demethylierung der Pektinmatrix hat Auswirkungen auf die physikalischen Eigenschaften der Zellwand.

Durch MALDI- bzw. ESI-TOF Untersuchungen von Maispollenproben und Datenbankrecherchen wurden unterschiedliche Pektin Methylesterasen identifiziert. Nach Erhalt der vollständigen cDNSs wurden diese in bakterielle und eukaryotische Expressionsvektoren kloniert. Von den vier identifizierten PMEs besitzen zwei Isoformen eine für Typ I charakteristische Prodomäne. Die anderen zwei Isoformen besitzen keine Prodomäne und gehören zu den Typ II PMEs. Mit Hilfe der rekombinanten Proteine sollen, mittels in vitro Untersuchungen, die biologische(n) Funktion(en) aufgeklärt werden. Mittels semiquantitativer RT-PCR wurde die Expression dieser Gene aus verschiedenen Pflanzenorganen ermittelt. PMEI-RP Expression konnte nur in Antheren und sich entwickelnden Pollen nachgewiesen werden. Die PMEs wurden hingegen sowohl in Maisblättern, Pollen, als auch in weiteren Pflanzenorganen exprimiert. Die subzelluläre Lokalisation der PMEIRPs in Pollen wurde zusätzlich durch differentielle Extraktion, durch immunocytochemischen Untersuchungen und durch transiente Expression von PMEI-RP::Reportergen-Chimären untersucht.

Erstaunlicherweise führten die rekombinanten und nativen PMEI-RPs weder zu einer Inhibition der PME-Aktivität noch zu einer Inhibition mit Invertasen (Zellwand und Vakuolen-Isoformen).

Darüber hinaus wurden ß-1,3-Glucanasen, Polygalacturonasen und Inulasen durch in vitro Tests als mögliche Zielproteine ausgeschlossen. In Größenausschluss-Chromatographien unterschiedlicher Maispollen-Proben und rekombinanter PMEI-RPs konnten nur monomere PMEI-RPs bei ihrem erwarteten Mr ohne Hinweis auf einen Bindepartner nachgewiesen werden. Versuche die Proteinkomplexe durch Cross-Linker zu quervernetzen, führten ebenfalls zu keinen nachweisbaren PMEI-RP Zielproteinkomplexen.

Es liegt nahe, dass einige Isoformen der kürzlich identifizierten komplexen PMEI-RP Familien entweder andere Zielproteine als Pektin Methylesterasen und Invertasen haben, oder alternativ,

–  –  –

weitere noch unbekannte Funktionen aufweisen. Die Expression der PMEI-RP2 Isoform führte zu einer Reduktion des Pollenschlauchwachstums, was auf eine Interaktion von PMEI-RPs mit PMEs deuten könnte.

1 Summary

Pectin methylesterase (PME) and PME-inhibitor(PMEI)-related proteins in maize pollen:

Gene expression, subcellular localisation and functional characterisation During pollen development and pollen tube growth, dynamic changes in the pectin component of the cell wall are thought to play a crucial role. In particular, pectin methylesterase-mediated demethylation affects the physical properties of the cell wall.

Through MALDI- and ESI-TOF studies of maize pollen samples respectively and databank researches different pectin methylesterases have been identified. After aquiring the full length cDNAs they were cloned into bacterial and eukaryotic expression vectors. Among the four identified PMEs, two isoforms contained a prodomain, which is typical for type I PMEs, whereas the other two were without, which is typical for type II PMEs. With the help of the recombinant proteins, the biological functions of the target proteins should be clarified through in vitro assays.

Via semiquantitative RT-PCRs the expression in different plant tissues has been determined. PME expression could be confirmed in maize leaves, pollen, as well as in other plant tissues. PMEI expression could only be observed in pollen. The subzellular localization of the PMEI-RPs was also adressed by differential extraction, by immunocytochemical analysis, and by transient expression of PMEI-RP::reportergen fusions. Surprisingly, recombinant and native PMEI-RPs showed no inhibition of PME activity, neither was an inhibition of invertases (vacuolar and cell wall isoforms) observed. Additionally ß-1,3-glucanase, polygalacturonase and inulase have been excluded as target proteins by in vitro assays. Size exclusion chromatography of different maize pollen samples and recombinant PMEI-RPs revealed only free PMEI-RPs at their expected Mr with no indication of binding to other target proteins. Also, cross-linking experiments failed so far to identify any target enzyme(s) for the cloned PMEI-RPs.

The conclusion is, that some members of the recently identified, complex PMEI-RP families either bind to target enzymes other than invertases and PMEs, or alternatively, exhibit additional yet unknown functions. The transient expression of PMEI-RP2 resulted in a reduction in pollen tube length, indicating a possible interaction of PMEI-RPs with PMEs.

2. Einleitung

2 Einleitung Im Folgenden werden zelluläre Prozesse und Komponenten, die am Pektinstoffwechsel und der sexuellen Fortpflanzung von Pflanzen beteiligt sind, dargestellt. Zuerst werden die Aufgaben und Funktionen des Pollens, des männlichen Gametophyten, erläutert.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 17 |


Similar works:

«Hydrophobe III rd International Conference on Surface Technology with Water Repellent Agents, Aedificatio Publishers, 21–36 (2001) Water A Paradox, the Prerequisite of Life But the Cause of Decay L.G.W. Verhoef Delft University of Technology, Faculty of Architecture, Department of Restoration, Re-use and Renovation of Buildings Abstract Throughout the centuries human beings have sought shelter. Initially their needs were extremely simple, no more than protection against rain and wind and the...»

«DISCUSSION Freedom of Association Is Not the Answer* Sarah Fine Cosmopolitan liberals have long argued that, contrary to prevailing practices and assumptions, there is a tension between liberal principles, on the one hand, and the coercively enforced borders and exclusive membership practices that are familiar features of nation states, on the other hand.1 In that vein, it has become common to emphasize the liberal commitments to universalism and moral equality and to highlight the moral...»

«BENUTZERHANDBUCH Buchinhalt Inhaltsverzeichnis..................................... i Willkommen bei CorelDRAW Graphics Suite X3.............. 3 CorelDRAW......................................... 19 Corel PHOTO-PAINT.................................. 255 CorelDRAW Index................................... 447 Corel PHOTO-PAINT Index.....»

«Conversion in Luke-Acts: The Potential of a Cognitive Approach Joel. B. Green The importance of conversion in the Lukan narrative is signaled immediately in the opening chapter of the Gospel,1 in Gabriel’s summary of the effect of John’s ministry: He will turn many of the people of Israel to the Lord their God.he will go before him, to turn the hearts of fathers to their children, and [to turn] the disobedient to the wisdom of the righteous, to make ready a people prepared for the Lord....»

«Wissenschaftliche Kooperation Gemeinsame Projekte Paderborn – Le Mans Vorträge, Kolloquien und Publikationen: Kolloquium 22.-23.November 2007 (Le Mans) Orthodoxie et hétérodoxie dans l’Europe des Lumières Publikation Quéval, Marie-Hélène (dir.), Orthodoxie et hétérodoxie, Religion et Libertinage, dans l’Europe des Lumières, Saint-Etienne : PUSE, 2010. Résumé Dès l’Antiquité, des voix s’élèvent contre le christianisme naissant, l’écrit le plus connu nous ayant été...»

«Dr Dhagash Mehta Postal Add.: 152B, Hurley Hall, Dept of Applied and Computational Mathematics and Statistics, University of Notre Dame, Notre Dame, IN 46556, USA. Email: dmehta@nd.edu; dhagashb@yahoo.com. Ph: +1-574-631-6726 _ Academic Positions Aug 2014 Present Research Assistant Professor in the Dept of Applied and Computational Mathematics and Statistics in conjunction with the Dept of Chemical and Biomolecular Engineering at University of Notre Dame, South Bend, IN, USA. Mentor: Associate...»

«25 Kenneth Goldsmith’s Waste-Management Poetics The Waste-Management Poetics of Kenneth Goldsmith Christopher Schmidt For those who follow closely the contemporary American poetry scene, perhaps no recent figure has made a greater intervention in received ideas of poetic excellence than Kenneth Goldsmith. This self-described “conceptual poet” has managed to become “the most critically wellinspected writer now under the age of 50 in the United States” by ceding all claims to authorial...»

«Arbeitskreis Energie in der Deutschen Physikalischen Gesellschaft Vorträge auf der Berliner DPG-Tagung (2014) Herausgeber: Die Grafik des Titelblatts wurde Arbeitskreis Energie (AKE) in der DPG unter Verwendung von Abbildungen Prof. Dr. Hardo Bruhns aus den Beiträgen von M. Meliesallee 5 Kosinowski, A. Moser und M. Noe 40597 Düsseldorf mit freundlicher Genehmigung der Autoren gestaltet. E-Mail: ake@bruhns.info Energie Forschung und Konzepte Vorträge auf der DPG-Frühjahrstagung in Berlin...»

«School of English and American Studies Faculty of Humanities Eötvös Loránd University New Concepts and Approaches in English and American Studies PhD Conference November 13-14, 2008 Venue: Trefort-kert campus of Eötvös Loránd University 1088 Budapest, Múzeum krt. 4/A and Rákóczi út 5. School of English and American Studies Faculty of Humanities Eötvös Loránd University 1088 Budapest, Rákóczi út 5.Website of the School: http://seas3.elte.hu Website of the Conference:...»

«EINKANAL-TEMPERATURREGLER Artikel-Nr. 61001012 Der steckerfertige Einkanal-Temeperaturregler im stabilen Kunststoffgehäuse ist bis zu einer Gesamtleistungsabgabe von 3650 W bei 230V ausgelegt.Funktion: Die Temperaturregler ist im Wandgehäuse untergebracht und eignet sich besonders im Industriebereich zum temperieren von Heizschläuchen oder anderen Heizungen. Durch den Hauptschalter kann die Kombination 2-polig vom Netz getrennt werden. Sicherheitshinweise, Installationshinweise Vor der...»

«Tracing Your Ancestors in the UK Volume I Genealogy. An Introduction to Genealogy. By Rosamunde Bott BA (Hons) Step-by-Step Volume II, a Step-by-Step Guide to Tracing Your Ancestry, provides detailed advice, step-by-step Ancestry, step-byresources procedures and more information about resources and use how to use them. You can buy Volume II HERE for the special offer price of $15 (normally $25) _ Tracing Your Ancestors in the UK Vol. 1 © Rosamunde Bott 2010 TABLE OF CONTENTS VOLUME I Table of...»

«‘Hong Kong Exchanges and Clearing Limited and The Stock Exchange of Hong Kong Limited take no responsibility for the contents of this announcement, make no representation as to its accuracy or completeness and expressly disclaim any liability whatsoever for any loss howsoever arising from or in reliance upon the whole or any part of the contents of this announcement. ANNOUNCEMENT OF ANNUAL RESULTS FOR THE YEAR ENDED 31 DECEMBER 2015 RESULTS The Board is pleased to announce the consolidated...»





 
<<  HOME   |    CONTACTS
2016 www.abstract.xlibx.info - Free e-library - Abstract, dissertation, book

Materials of this site are available for review, all rights belong to their respective owners.
If you do not agree with the fact that your material is placed on this site, please, email us, we will within 1-2 business days delete him.