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«INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Isabel ...»

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Charakterisierung der Interaktion

zwischen dem tumorassoziierten Protein Np9

des humanen endogenen Retrovirus HERV-K (HML-2)

und der humanen Serin-Protease (HumHtrA2)

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Dr. med. vet.

beim Fachbereich Veterinärmedizin

der Justus-Liebig-Universität Gießen

Isabel Brand

Institut für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin

Betreuer: Prof. Dr. T. Rümenapf

und

Institut für Virologie der Universität Homburg Betreuer: Prof. Dr. N. Müller-Lantzsch Charakterisierung der Interaktion zwischen dem tumorassoziierten Protein Np9 des humanen endogenen Retrovirus HERV-K (HML-2) und der humanen Serin-Protease (HumHtrA2)

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet.

beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von Isabel Brand Tierärztin aus Saarbrücken Gießen, 2005 Mit Genehmigung des Fachbereiches Veterinärmedizin der Justus-Liebig Universität Gießen Dekan: Prof. Dr. Reinacher Gutachter: Prof. Dr. Rümenapf Prof. Dr. Müller-Lantzsch Prof. Dr. Lämmler Disputation: 1. Dezember 2005 Danksagung Herrn Prof. Dr. Müller-Lantzsch danke ich recht herzlich für die Betreuung der Doktorarbeit, die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und insbesondere für das Entgegenkommen, eine externe veterinärmedizinische Dissertationsarbeit in der Abteilung für Virologie anfertigen zu dürfen.

Ganz besonders möchte ich mich bei Frau Dr. Marlies Sauter bedanken, die mir während der gesamten Arbeit jederzeit mit wertvollen Ratschlägen hilfreich zur Seite gestanden hat.

Ich danke Herrn Prof. Dr. Rümenapf recht herzlich für die hilfreiche Unterstützung bei der schriftlichen Abfassung der Dissertationsarbeit.

Ebenso herzlich möchte ich mich bei Frau Barbara Best bedanken, für die tatkräftige Unterstützung im Labor und die zahlreichen nützlichen Tipps und freundlichen Worte.

Eine Erwähnung möchte ich Sandra Kehr, Thorsten Pöhland und Miriam Denne zukommen lassen, durch die mir die letzten Monate als eine besonders „Gute Zeit “ in Erinnerung bleiben werden.

Von Herzen danken möchte ich insbesondere meinen Eltern, die mir immer zur Seite gestanden haben, meiner Schwester Vanessa und besonders meinem Freund Martin, der sich mal wieder als mein bester Freund erwiesen hat.

Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 Einlei

–  –  –

Einleitung

1.1 Retroviren Bis Anfang der siebziger Jahre waren sich die Molekulargenetiker einig, daß infektiöse Partikel in Form eines Retrovirus nicht existieren können. Die Erbinformation - so glaubte man - wird ausschließlich von der DNA zur RNA und weiter zu den Proteinen gegeben; diesen Weg des Informationsflusses bezeichnete man als das “ Zentrale Dogma der Molekularbiologie“.

H. Termin widerlegte dieses nicht nur durch die Entdeckung des Mechanismus der Reversen Transkription, sondern postulierte außerdem sogenannte „retrovirale Sequenzen“ als einen normalen Bestandteil menschlicher Zellen (Termin, 1974). Anfang der achziger Jahre wurde mit der Entdeckung von HIV das bislang bedeutenste exogene Retrovirus beschrieben (Barre-Sinoussi et al., 1983). Die Existenz endogener Retroviren wurde von Löwer et al. fast zeitgleich durch die Entdeckung von HTDVPartikel (human teratocarcinoma-derived virus) in Überständen von Teratokarzinomzelllinien näher charakterisiert und Jahre später wurden diese als HERV-K(HML-2)-kodierte Partikel identifiziert (Löwer et al., 1984; Boller et al., 1993). Retroviren sind heute eine wichtige Familie in der biologisch/medizinischen Forschung. Ihre herausragende Bedeutung verdanken diese nicht nur ihrem einzigartigen Replikationsmechanismus, der die Integration intermediärer Formen in das Genom der Wirtszelle erfordert, sondern außerdem ihrer Assoziation mit zahlreichen klinisch relevanten Krankheitsbildern sowohl in der Human- als auch der Veterinärmedizin (vgl.Tab.1). Die Bedeutung humaner endogener Retroviren (HERV) sowie die potentielle Gefahr endogener Retroviren anderer Spezies für das menschliche Genom insbesondere im Rahmen der heterologen Organspende sind aktuelle Forschungsschwerpunkte mit nicht zu unterschätzender klinischer und wirtschaftlicher Relevanz.

1. Einleitung 2 1.2 Klassifikation der Retroviren Ein Überblick über die Klassifikation der Retroviren und Vertreter der einzelnen Subfamilien zeigt Tab. 1.

–  –  –

Die Familie der Retroviren ist in sieben Genera, namentlich α-, β-, γ-, δ- und εRetroviren, sowie Spumaviren und Lentiviren untergliedert. Diese Unterteilung basiert neben genetischen und morphologischen Aspekten auf Besonderheiten der Infektion und der induzierten Krankheitsbilder. Die ersten fünf in Tab. 1 gelisteten Genera können nach ihrem pathogenen Potential zur Gruppe der Onkoviren zusammengefaßt werden, da sie insbesondere als kausale Agenzien in der Tumorgenese diskutiert werden. Spumaviren zeichnen sich charakteristischerweise durch persistierende, klinisch inapparente Infektionen aus. Das Genus der Lentiviren beinhaltet retrovirale Vertreter, deren Infektion sich durch einen anfänglich inapparenten, aber langsam progressivem Krankheitsverlauf mit meist letalem Ende auszeichnet (Fields et al., 1996). Eine weitere Unterteilung der Retroviren bezüglich der Komplexizität der Genomstruktur ist möglich. Neben den im retroviralen Lebenszyklus grundsätzlich erforderlichen Proteinen werden von einer Vielzahl an Retroviren sogenannte akzessorische Proteine kodiert, die an funktionellen Schlüsselpositionen die effiziente Virusvermehrung gewährleisten (vgl. Kap. 1.4).





1.3 Genomorganisation des infektiösen Partikels und des Provirus

Der Aufbau des retroviralen Genoms eines infektiösen Viruspartikels (Virion) und der ins Wirtsgenom integrierten proviralen Form (Provirus) unterscheiden sich maßgeblich voneinander. Im Virion liegt die genetische Information in Form einer einzelsträngigen, diploiden RNA in “+- Orientierung“ vor; mit der 5`Cap-Struktur und der 3`-Polyadenylierungsequenz besitzt sie alle Charakteristika einer eukaryotischen mRNA. Die Cap-Struktur dient dem Schutz vor einem Abbau durch zelluläre Nukleasen, die Polyadenylierungssequenz ist Voraussetzung zur Nutzung der eukaryotischen Translationsmaschinerie. Die für die gag, pol und env- Genprodukte kodierenden Sequenzen werden von regulatorischen Kontrollelementen flankiert, die neben der Promotorsequenz die Primer-Bindungsstelle (PBS) für transaktivierende zelluläre und virale Proteine beinhalten (vgl. Abb. 1a). Das Genom aller infektiösen Retroviren enthält einen offenen Leserahmen für die

1. Einleitung 4 Produkte Gag (gruppenspezifisches Antigen), Pol (enzymatische Aktivitäten) und Env (Glykoproteine) (vgl. Kap.1.4). Die kodierenden Regionen werden am 5`- und 3`-Ende des Genoms von nicht kodierenden, aber regulatorisch wichtigen Kontrollsequenzen flankiert, welche sowohl für die Reverse Transkription als auch die Integration der viralen Erbinformationen in die zelluläre DNA essentiell sind. Nach der Reversen Transkription liegt eine doppelsträngige DNA vor, die in die zelluläre DNA integriert wird; es entsteht das Provirus. Das provirale Genom wird jetzt von den LTRs (long terminal repeats) flankiert, die sich ihrerseits in U3, R und U5 Domänen unterteilen lassen. Diese entsprechen der Anordung der terminalen Sequenzbereiche nach der Reversen Transkription (vgl. Abb. 1b). Entsprechend einem zellulären Gen erfolgt die Initiation der viralen Transkription durch eine Veränderung der Zusammensetzung der Transkriptionsaktivatoren und – repressoren am LTR (Collingwood et al., 1999). Das Zusammenspiel zellulärer Faktoren am LTR hängt neben der Verfügbarkeit der benötigten Proteine maßgeblich von der Sequenz der LTRs ab. Aufgrund dessen stellen die Bindungsstellen im viralen LTR die zweite virale Determinante der Wirtszellspezifität nach dem Fusionsprozeß an der Wirtszelloberfläche dar (Maury et al., 2000).

Abbildung 1a: Schema des RNA-Genom des infektösen Viruspartikels Genomorganisation der Retroviren; Anordung der Sequenzelemente und offener Leserahmen; Das Genom ist am 5`-Ende mit einer Cap-Gruppe modifiziert, das 3`-Ende ist polyadenyliert. An die PBSRegion (Primer Binding site) wird eine tRNA gebunden. R: wiederholte (redundant) Regionen; U3 und U5: besondere (unique) Regionen am 3`- bzw. 5`-Ende. Die für Gag, Pol- und Env-Proteine kodierenden Regionen sind durch dunkelschattierte Bereiche angedeutet (nach http://www.med.sc.edu:85/lecture)

1. Einleitung 5 Abbildung 1b: Schema der integrierten Provirus-DNA Anordung der Sequenzelemente und offener Leserahmen des Provirus nach Integration in das Wirtszellgenom. LTR (long terminal repeat) kennzeichnet die Anordung der Sequenzelemente, die im Verlauf der reversen Transkription gebildet werden (nach http://www.med.sc.edu:85/lecture)

1.4 Genprodukte

Retroviren besitzen für Gag-, Pol- und Env-Proteine kodierende Sequenzen.

Die gag- Region befindet sich in fast allen Retroviren stromabwärts des 5`LTR und kodiert für das Matrix- (MA), Kapsid- (CA) und das Nukleokapsidprotein (NC). Die Translation erfolgt in Form eines GagVorläuferproteins, welches durch die viruskodierte Protease in die funktionellen Einzelkomponenten gespleißt wird. Diese Autoprozeßierung erfolgt in unmittelbarem Zusammenhang mit der als “budding“ bezeichneten Abknospung des Virions an der Zelloberfläche (Kräusslich und Welker, 1996).

Durch Anlagerung des MA-Proteins mittels einer aminoterminal lokalisierten Myristylsäure-Modifikation an die Innenseite der Wirtszellmembran wird die retrovirale Partikelbildung eingeleitet (Yu et al., 1992). Das CA-Protein umgibt den über ein Zinkfinger-Motiv gebildeten NC-RNA- Komplex, der im reifen Virion von der MA-Hülle umgeben ist (Sakalian und Hunter, 1998). Komplexe Retroviren, zu denen Lentiviren, Spumaviren und einige Vertreter der Onkoviren gerechnet werden, besitzen zusätzlich eine Vielzahl kleiner, offener Leserahmen zur Synthese akzessorischer Proteine mit bislang noch nicht eindeutig geklärter Funktion (Löwer et al., 1995). Diese besitzen teilweise eine solch essentielle Bedeutung, daß im Falle ihrer genetischen oder funktionellen Defizienz die Infektiösität des Virus verloren gehen kann. Beispiele finden sich

1. Einleitung 6 unter anderem bei HIV (p6), RSV (p23) oder bei MLV (p12) (Vogt in Coffin et al., 1997).

Der pol- Leserahmen, dessen weitere Untergliederung in prt und pol möglich ist und stromab des gag-Gen lokalisiert ist, kodiert für die retroviralen Enzyme;

hierzu gehören die Protease (prt-kodiert), die Reverse Transkriptase und die Integrase (beide pol-kodiert). Die Protease spaltet das Gag-Vorläuferprotein in die funktionellen Einzelkomponenten. Bei HIV findet sich ein durchgehend offener Leserahmen für die Bereiche prt und pol, wodurch ein gemeinsames Vorläuferprotein translatiert wird, aus welchem sich die Protease autokatalytisch freisetzt (Vogt in Coffin et al., 1997). Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die RNA in DNA umzuschreiben in der Lage ist. Mit Hilfe der RNase H-Aktivität baut diese spezifisch RNA in RNA-DNA-Hybriden ab; ihr fehlt jedoch eine „proofreading“Funktion zur Überprüfung der Lesegenauigkeit. Die Integrase dient der Integration des revers transkribierten Virusgenoms in die DNA der Wirtszelle.

Zunächst schneidet diese die zelluläre Doppelstrang-DNA, um anschließend die proviralen Enden in die entstandene Schnittstelle zu ligieren (Levy,1994).

Aufgrund der Tatsache, daß die Protease bei der Reifung des infektiösen Partikels und die Proteine des pol- Bereichs nach Infektion der Zelle unmittelbar zur Integration in das Wirtszellgenom essentiell sind, werden diese als enzymatische Grundausstattung in das Virion eingelagert. Dies betrifft auch einige der akzessorischen Proteine (Karczewski und Strebel, 1996;

Welker et al., 1996; Fackler et al., 1996).

Von dem env- Leserahmen, der sich am 3`-Ende des viralen Genoms befindet, werden zwei Glykoproteine in Form eines Env-Vorläuferproteins translatiert, welche durch einfaches Spleißen aus der RNA hervorgehen. Das Vorläuferprotein wird im Endoplasmatischen Retikulum (ER) um das Signalpeptid gekürzt, im Golgi-Apparat posttranslational modifiziert und durch zelluläre Proteasen in die beiden funktionellen Untereinheiten SU (surface) und TM (transmembrane) gespalten. Das größere SU-Protein befindet sich ausschließlich außerhalb der Wirtszellmembran und ist für die Rezeptorbindung verantwortlich, das kleinere TM-Protein verankert den SUAnteil in der Zellmembran. Bei HIV wurde kürzlich eine Konformationsänderung der TM-Domäne für eine effiziente Bindung der SUEinleitung 7 Domäne an den CD4-Rezeptor verantwortlich gemacht (Hildinger et al., 2001).

Im Falle einer retroviralen Infektion werden neutralisierende Antikörper gegen die Epitope beider Membranproteine gebildet. (Molekulare Virologie; Modrow, Falke und Truyen, 2. Auflage, 2003).

1.5 Zelltransformation und Tumorgenese

Schon früh erkannte man, daß Viren in der Lage sind, tumoröse Erkrankungen hervorzurufen. Bereits 1911 postulierte Peyton Rous, daß Viren beim Geflügel maligne Tumoren verursachen können. DNA-Viren, wie das tierpathogene SV40 (simian virus 40) führen teilweise wirtsabhängig zu einer Lyse ihrer Wirtszelle (Rajevskaya et al., 1989). In jenen Zellen, in denen kein lytisches Wachstum erfolgt, wird ein Teil oder das gesamte virale DNA-Genom in das Wirtsgenom integriert, was zur malignen Entartung der Zelle führen kann.

Ursächlich werden in diesem Zusammenhang virale Proteine verantwortlich gemacht (z.B. das T-Antigen bei SV40), welche an die Tumorsuppressoren Rb und p53 der Wirtszelle binden und diese inaktivieren (Guenal et al., 1995). Die Inaktivierung dieser Tumorsuppressoren führt zum Verlust der Zellzykluskontrolle und damit zu einem unkontrollierten Zellwachstum. Die meisten Viren, die mit Tumorerkrankungen des Menschen korreliert sind, besitzen ein DNA-Genom. Man schätzt, daß etwa 15- bis 20 Prozent aller humanen Krebserkrankungen ätiologisch mit Virusinfektionen assoziiert sind.



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