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«- Expression von Genen des Nitratassimilationssystems - Abschätzung des pilzlichen rRNA-Anteils in der Symbiose - Wachstum von Glomus intraradices ...»

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Untersuchungen

zur molekularbiologischen

Charakterisierung der Nitratassimilation

in der Symbiose zwischen dem

arbuskulären Mykorrhizapilz Glomus

und Tomate

- Expression von Genen des Nitratassimilationssystems

- Abschätzung des pilzlichen rRNA-Anteils in der Symbiose

- Wachstum von Glomus intraradices ohne Wirt

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Universität zu Köln

vorgelegt von

Ulrich Hildebrandt aus Grevenbroich Hundt Druck GmbH, Köln Berichterstatter: Prof. Dr. H. Bothe Prof. Dr. Hj.A.W. Schneider-Poetsch Tag der letzten mündlichen Prüfung: 07.11. 2000 Abstract The role of the arbuscular mycorrhizal (AM) fungus Glomus intraradices in assisting its host plant tomato in nitrate assimilation was studied. Parts of the genes coding for putative low- and high-affinity nitrate transporters (NTR), nitrate and nitrite reductases were specifically amplified from tomato root cDNA (or DNA) by PCR, subsequently cloned and sequenced.

Some characteristics of nitrate transporter genes were investigated: The low-affinity nitrate transporter gene Tomate-lo1 (LeNRT 1;1) and the putative high-affinity nitrate transporter genes Tomate-hi2 (LeNRT2;2) and Tomate-hi3 were expressed in nitrate-grown tomato roots, as demonstrated by Northern-analysis. In addition, the expression of tomato NTR-, nitrate and nitrite reductase genes was influenced by different external N-sources.

Tomate-hi2 and Tomate-hi3 differ in their transcript levels when glutamine was the sole Nsource in the nutrient solution.

In situ-hybridization experiments showed a tissue-specific localization of Tomate-lo1 and Tomate-hi3 transcripts in tomato roots. The results of RT-PCR-experiments indicate that the expression of tomato high-affinity nitrate transporter genes is not restricted to roots.

Northern-analyses show that the mRNA level of the putative high-affinity nitrate transporter gene Tomate-hi3 is significantly increased in mycorrhizal plants, whereas transcript levels of Tomate-hi2 and Tomate-lo1 remain more or less unaltered in mycorrhizal plants in comparison to non-colonized controls. The expression of Tomate-hi3 is expanded into cortical cells of mycorrhizal roots, in contrast to the situation in noncolonized roots, as shown by in situ-hybridization experiments. A specific expression in cells containing arbuscules was not observed.

Transcript levels of the tomato nitrate reductase gene were only weakly increased in leaves of mycorrhizal plants, whereas a significant increase in tomato nitrite reductase transcript levels in leaves of mycorrhizal tomato was observed. The specific nitrate reductase activity of mycorrhizal plants was slightly increased in all experiments.

Glomus nitrate reductase mRNA was detected in mycorrhizal tomato roots by Northernanalysis. RT-PCR-experiments and activity measurements indicate that the fungal nitrate reductase is expressed in the extraradical mycelium of Glomus intraradices.

The data-set obtained is discussed with respect to the role of AM-fungi in nitrateassimilation in the arbuscular mycorrhizal symbiosis.

Data on AM-fungal biomass do not necessarily represent the fungal rRNA content in mycorrhizal roots. Therefore RNA-Dot-Blot experiments were performed using the internal transcribed spacer-5.8S ribosomal DNA as a molecular probe to assess the proportion of fungal rRNA in mycorrhizal roots. The obtained data suggest that the AMfungal rRNA might represent up to 50% of total mycorrhizal root RNA.

Insufficiently surface-disinfected spores of Glomus intraradices allowed the isolation of an AM-associated bacterium (Paenibacillus sp.). The co-culture of germinating spores of Glomus intraradices Sy167 with Paenibacillus sp. was monitored. Presence of Paenibacillus sp. led to an improved growth of Glomus-hyphae and to morphological alterations of the formed mycelium. A more intense branching, the formation of arbusculelike structures and spores was observed. The morphology of Glomus intraradices germinated with Paenibacillus sp. differed in comparison to structures observed in an AMculture system with Ri T-DNA transformed carrot-roots.

Kurzzusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe molekularbiologischer Methoden der Einfluß einer Mykorrhizierung mit dem arbuskulären Mykorrhizapilz Glomus intraradices auf die Expression von Genen des Nitratassimilations-Systems der Wirtspflanze Lycopersicon esculentum (Tomate) untersucht.

PCR-Experimente führten zur Klonierung von 3´-nicht-translatierten Bereichen je zweier lowund high-affinity Nitrattransportergene (Tomate-lo1 (=LeNRT1;1), Tomate-lo2(=LeNRT1;2), Tomate-hi2 (=LeNRT2;2) und Tomate-hi3) von Tomate. Wie Sequenzvergleiche und Southern-Hybridisierungen zeigen, handelt es sich bei Tomate-hi3 um ein bisher unbekanntes zu high-affinity Nitrattransportern homologes Gen aus Tomate. Untersuchungen zur Nitratinduzierbarkeit von Tomate-lo1, Tomate-hi2 und Tomate-hi3 ergaben, daß alle untersuchten Nitrattransportergene durch exogenes Nitrat induzierbar sind und daher deutlich erhöhte Transkriptmengen nach einer Nitratgabe aufweisen.

Darüber hinaus wird die Expression der untersuchten Tomaten NTR-, Nitrat- und Nitritreduktasegene durch unterschiedliche von außen angebotene Stickstoffquellen beeinflußt.





Deutliche Unterschiede bezüglich der Transkriptmengen von Tomate-hi2 und Tomate-hi3 treten mit Glutamin als einziger Stickstoffquelle auf.

Durch RNA In situ-Hybridisierungen konnte in Tomatenwurzeln eine gewebsspezifische Transkript-Lokalisierung für Tomate-lo1 und Tomate-hi3 gezeigt werden. Die Resultate von RT-PCR-Experimenten deuten allerdings auch auf eine Expression in oberirdischen Pflanzenteilen von Tomate hin.

Durch Northern-Hybridisierungen konnte gezeigt werden, daß die Transkriptmenge von Tomate-hi3 in mykorrhizierten Tomatenwurzeln, im Vergleich zu nicht-mykorrhizierten Wurzeln, etwa zweifach erhöht ist. Die Expression der beiden weiteren untersuchten Nitrattransportergene Tomate-lo1 und Tomate-hi2 wird durch eine Mykorrhizierung unter den gewählten Bedingungen nur in geringem Maße beeinflußt.

In den Wurzeln mykorrhizierter Tomatenpflanzen wird Tomate-hi3, im Gegensatz zu nichtmykorrhizierten Wurzeln, zusätzlich zur Rhizodermis in weiter innen gelegenen Schichten des Rindenparenchyms älterer Wurzelabschnitte exprimiert. Eine verstärkte Expression in Arbuskel-enthaltenden Zellen konnte nicht beobachtet werden.

Im Vergleich zu den Wurzeln der Kontrollpflanzen ist die Expression des Nitritreduktasegens in den mykorrhizierten Wurzeln leicht erhöht, während kein deutlicher Unterschied für das Nitratreduktasegen zu erkennen ist. In den Blättern mykorrhizierter Pflanzen sind für beide Gene leicht erhöhte Transkriptmengen zu beobachten. Die Nitratreduktase-Aktivität mykorrhizierter Tomatenpflanzen ist, im Vergleich zu nicht-mykorrhizierten Kontrollpflanzen, in Wurzeln und Blättern leicht erhöht.

Durch Northern-Hybridisierungen mit einer Sonde für ein Nitratreduktasegen aus Glomus intraradices Sy167 konnte gezeigt werden, daß dieses in mykorrhizierten Wurzeln exprimiert wird. Erstmals konnte eine In vitro-NR-Aktivität mit Rohextrakten des extraradikalen Myzels von Glomus intraradices nachgewiesen werden.

Die Rolle arbuskulärer Mykorrhizapilze bei der Nitratassimilation in der Symbiose wird unter Bezugnahme auf die erhaltenen Ergebnisse diskutiert.

RNA-Dot-Blot Hybridisierungen mit einer ITS-5,8S-rDNA Sonde von Glomus intraradices deuten auf einen bis zu 50%igen Anteil pilzlicher rRNA an der Gesamt-RNA mykorrhizierter Wurzeln hin.

Die Co-Kultur des als obligat biotroph geltenden AM-Pilzes Glomus intraradices Sy167 mit dem AM-assoziierten Bakterium Paenibacillus sp., führt zu deutlich verstärktem Wachstum, morphologischen Veränderungen und zur Ausbildung von Sporen.

Inhaltsverzeichnis

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2.7.2 Fixierung von mykorrhizierten und nicht-mykorrhizierten Tomaten- 38 wurzeln mit Glutaraldehyd 2.7.3 Einbettung in Fibrowax

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2.8.1 Herstellung von Proteinrohextrakten aus Pflanzen- und Pilzmaterial 42 2.8.2 Messung der Nitratreduktaseaktivität in Proteinrohextrakten 43

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3.1 PCR-Amplifizierung von DNA-Segmenten aus Genen, die für Be- 45 standteile des Nitratassimilationssystems höherer Pflanzen kodieren 3.1.1 Identifizierung konservierter Sequenzbereiche in Nitrattransporter- 45 genen höherer Pflanzen 3.1.1.1 Identifizierung konservierter Sequenzbereiche von low-affinity 46 Nitrattransportern 3.1.1.2 Identifizierung konservierter Sequenzbereiche von high-affinity 47 Nitrattransportern

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3.1.5 Analyse der PCR-Produkte - Klonierung und Sequenzierung von 51 Teilsegmenten von Nitrattransporter-, Nitratreduktase- und Nitritreduktasegenen

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3.1.6 Entwicklung von Sonden unter Verwendung des 3´-RACE- 56 Verfahrens zur Analyse der Expression von pflanzlichen Nitrattransportergenen 3.1.6.1 Auswahl geeigneter Sequenzbereiche zur Herstellung von gen- 57 spezifischen Primern für low- und high-affinity Nitrattransportergene zur Durchführung von 3´-RACE-Experimenten 3.1.6.2 3´-RACE-Experimente zur Amplifizierung von 3´-nicht-translatierten 57 cDNA-Enden von Nitrattransportergenen von Tomate 3.1.6.3 RT-PCR-Nachweis: T1-7 und PNT5.7-1 sind Bestandteile von 61 Tomate-hi3

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3.3 Resultate von Hybridisierungen zwischen PCR-Produkten klonierter 64 high-affinity Nitrattransportergensegmente mit genomischer DNA aus Tomate

3.4 Untersuchungen zur Expression von Nitrattransportergenen in 65 Wurzeln und oberirdischen Pflanzenteilen von Tomate 3.4.1 Untersuchungen zur Induzierbarkeit von Nitrattransportergenen in 66 Tomate durch Nitrat 3.4.2 Expression von low- und high-affinity Nitrattransportergenen in der 67 Lichtphase im Tagesgang 3.4.3 Einfluß verschiedener Stickstoffquellen auf die Expression von 69 Nitrattransportergenen in Tomatenwurzeln 3.4.4 RT-PCR-Nachweis von Nitrattransportertranskripten in oberirdischen 72 Pflanzenteilen von Tomate

3.5 Lokalisierung von Nitrattransportertranskripten in mykorrhizierten 76 und nicht-mykorrhizierten Tomatenpflanzen 3.5.1 Lokalisierung der Transkripte von low- und high-affinity Nitrat- 76 transportergenen in Tomatenwurzeln 3.5.2 Lokalisierung der Transkripte von low- und high-affinity Nitrat- 79 transportergenen in mykorrhizierten Tomatenwurzeln 3.5.3 Lokalisierung von Nitrattransportertranskripten in Geweben ober- 82 irdischer Pflanzenteile von Tomate

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3.7 Expression von Nitratreduktase- und Nitritreduktasegenen von 85 Tomate in mykorrhizierten und nicht-mykorrhizierten Tomatenpflanzen

3.8 Expression des Nitratreduktasegens von Glomus intraradices Sy167 85 in mykorrhizierten Tomatenwurzeln

3.9 Bestimmung der Nitratreduktaseaktivität in Rohextrakten von 87 mykorrhizierten und nicht-mykorrhizierten Tomatenpflanzen sowie in Rohextrakten aus extraradikalem Myzel (ERM) von Glomus intraradices Sy167

3.10 RT-PCR-Nachweis von Nitratreduktasetranskripten mit RNA aus 88 extraradikalem Myzel (ERM) von Glomus intraradices Sy167

3.11 Einsatz einer rRNA-Sonde zur Abschätzung des rRNA-Anteils von 91 Glomus intraradices Sy167 an der Gesamt-RNA mykorrhizierter Tomatenwurzeln 3.11.1 RNA-Dot-Blot-Analysen zur Abschätzung des pilzlichen rRNA- 92 Anteils an der Gesamt-RNA mykorrhizierter Tomatenwurzeln

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4.1 Eigenschaften der zur Herstellung von Gensonden amplifizierten 101 Bereiche aus Nitrattransporter-, Nitratreduktase- und Nitritreduktasegenen

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4.3 Expression der Nitrattransportergene Tomate-lo1 und Tomate-hi3 105 sowie des Nitratreduktase- und eines Nitritreduktasegens von Tomate im Tagesgang

4.4 Einfluß verschiedener Stickstoffquellen auf die Expression von 106 Nitrattransportergenen, des Nitratreduktase- und eines Nitritreduktasegens in Tomatenwurzeln

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4.8 Expression von Nitrat- und Nitritreduktasegenen in der arbuskulären 116 Mykorrhiza

4.9 Abschätzung des pilzlichen rRNA-Anteils an der Gesamt-RNA 119 mykorrhizierter Tomatenwurzeln

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1.Einleitung

1.1 Mykorrhiza Der als Sammelbegriff für mehrere unterschiedliche Formen des symbiotischen Zusammenlebens von Landpflanzen und Pilzen gebräuchliche Ausdruck Mykorrhiza setzt sich aus den griechischen Wörtern mikès (Pilz) und rhiza (Wurzel) zusammen und wurde erstmalig von Frank (1885) zur Bezeichnung der Symbiose zwischen Bäumen und Pilzen verwendet („Mycorhiza“). Aufgrund morphologischer Kriterien werden endo- und ektotrophe Mykorrhizen unterschieden. Die von Frank (1885) beschriebene Symbiose wird heute als ektotrophe - oder Ektomykorrhiza bezeichnet. Bei der ektotrophen Mykorrhiza bilden die Pilzhyphen eine Art Mantel, der die Wurzeln umgibt, sowie ein dichtes Hyphengeflecht zwischen den Wurzelrindenzellen, das als Hartigsches Netz (Hartig, 1851) bezeichnet wird. Dabei bleiben die Pilzhyphen von wenigen Ausnahmen abgesehen extrazellulär (Werner, 1987).

Bei den endotrophen Mykorrhizen können die Pilzhyphen in Pflanzenzellen eindringen ohne jedoch das Plasmalemma zu überschreiten. Diese Gruppe wird im wesentlichen in drei Unterformen gegliedert (Werner, 1987): 1. die Orchideenmykorrhiza, 2. die Ericaceenmykorrhiza und 3. die arbuskuläre Mykorrhiza (AM). Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen befassen sich ausschließlich mit den letztgenannten AMPilzen.



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