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«Veterinary Sulfonamide Antibiotics in the Environment: Fate in Grassland Soils and Transport to Surface Waters A dissertation submitted to the SWISS ...»

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Diss. ETH No. 16348

Veterinary Sulfonamide Antibiotics

in the Environment: Fate in Grassland Soils and

Transport to Surface Waters

A dissertation submitted to the

SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH

for the degree of Doctor of Sciences

presented by

KRISPIN STOOB, Dipl. Umwelt-Natw. ETH

born on August 23, 1975; citizen of Eschenbach (SG), Switzerland

accepted on the recommendation of

Prof. Dr. René P. Schwarzenbach, examiner

Prof. Dr. Wulf Amelung, co-examiner PD Dr. Stephan R. Müller, co-examiner Dr. Christian H. Stamm, co-examiner Zurich 2005 Dank Ich bedanke mich ganz herzlich bei meinem Leiter René Schwarzenbach und bei meinen Betreuern Stephan Müller und Christian Stamm für die stete Diskussionsbereitschaft, die kompetente Begleitung und das mir entgegengebrachte Vertrauen während meiner ganzen Dissertationsjahre. «René, an dieser Stelle nochmals vielen Dank fürs ‹Überreden› zur Diss. – ich hab’s wirklich keine Sekunde bereut.» «Stephan, in deiner Gruppe eine Diss. zu erarbeiten hat riesig Spass gemacht. Speziell bedanke ich mich für deine motivierende Unterstützung für das ‹high risk›-Unternehmen Feldstudie, die zur Verfügung gestellten Ressourcen und die äusserst wertvollen ‹soft skills› die du mir vermittelt hast.»

«Christian, vielen Dank für den Support während der Feldstudie, für die spontane Übernahme der Betreuung in der 2. Phase des Projekts und die intensive Unterstützung im Schlussspurt!» Ich freue mich, Prof. Wulf Amelung in meinem Komitee gehabt zu haben.

Ohne exakte Analytik geht gar nichts; davon bin ich überzeugt. Ohne Heinz Singer wären die analytischen Methoden dieser Arbeit nicht von dieser Qualität. «Heinz, du hast mir die Faszination an der quantitativen chemischen Analytik übertragen. Die ‹strategischen› Schwatze mit dir und deine zahlreichen Tipps und Tricks, die weit über die Analytik hinausgingen, haben wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen – für mich warst du immer auch ein Betreuer.»

Zur Entwicklung der online SPE-Analytik haben Christian Götz und Matze Ruff unzählige Stunden ausserhalb der ‹Bürozeiten› am TSQ verbracht. Herzlichen Dank für die herrliche Zeit im und ausserhalb des D68. Die Bodenextraktionsmethode wurde zum Grossteil in den Diplomarbeiten von Sandra Stettler und Niccolo Hartmann entwickelt. «Sandra und Niccolo, euch in die Spurenanalytik einzuführen, eure Diplomarbeiten zu betreuen und mit euch zu diskutieren hat mich immer fasziniert und weitergebracht – ich erwähne nur ‹verbotenes Experiment› und ‹Bodenmix›.»

Die Feldstudie war ein höchst reizvolles ‹Grossexperiment›. Die beteiligten Betriebsleiter Benny Koch, Hans Kunz und Daniel Schwörer haben dieses mit ihrer Kooperation erst ermöglicht. Gabriel Popow und Samuel Gerber bin ich sehr dankbar für das ‹Einfädeln› der Kontakte vor Ort während der Vorbereitung der Studie. Die Mission ‹Feldstudie 2003› wurde durch Sibyl Brunner sensationell assistiert. «Sibyl, du hast dich sofort von der Praktikantin zur unersetzbaren Stellvertreterin entwickelt und mich tatkräftig unterstützt.» Die Zusammenarbeit mit der Universität Utrecht im Bereich Resistenzgene hat meinen mikrobiologischen Horizont stark erweitert. «Liebe Heike, vielen Dank für die angenehme Zusammenarbeit.» Ein solches Grossprojekt setzt zahlreiche Helfer und gute Seelen voraus. Das grosse Merci fürs ‹Profil Buddeln›, SamplingStation Bauen, Gülle Applizieren, Bodenproben Sammeln, Wasserproben Abfüllen, Akku Ersetzen, Kanal Reinigen, Flaschen Leeren, … geht an Sibyl Brunner, Michael Burkhardt, Karin Ghilardi, Anke Göbel, Luciana Gomides, J. Grimm AG, Christian Götz, Niccolo Hartmann, Maren Kahle, Alfi Lück, Andi Peter, Rüegsegger AG, Silke Richter, Matze Ruff, Christian Stamm, Sandra Stettler, Angela Thompsen, Markus Wälle, Christpher Waul, Werkstatt-Team Eawag. Cornelia Crespi und Ernst Butscher vom AfU Luzern danke ich für die Unterstützung bei den Probenahmen in der Region Sempach.

Speziell zu Dank verpflichtet bin ich Kathrin Fenner, Martin Frey, Irene Hanke, Andi Peter, Christian Stamm und Christoph Steiner für die wertvolle Unterstützung in der Schlussphase meiner Diss., sei es fürs Gegenlesen, Grafiken Perfektionieren oder ganz einfach fürs Kaffee Bringen.

Ich bin immer noch tief beeindruckt von der hammermässigen ‹Nachdissprüfung› und der anschliessenden Party! Der Dank für diesen einmaligen Event geht an die ganze Uchem-Gruppe mit ‹zugewandten Orten› und ganz speziell an ‹Klärschlamm›: «Holger, Kov, Merle, Marion, Maren, Nils & Christian G. – keep on rockin’!»

Eine solche Arbeit zu einem erfolgreichen Ende zu bringen, bedingt immer auch ein gutes Arbeitsumfeld und das hab ich an der Eawag vorgefunden. Speziell bedanken möchte ich mich bei den Kolleginnen und Kollegen aus dem ‹GruFo› der Professur Schwarzenbach und den Mitgliedern der neuen Abteilung Umweltchemie an der Eawag. Die Unterstützung meiner Arbeit und das Klima in unserer W+L-Gruppe hat mich oft beflügelt. Es war eine superschöne Zeit mit euch: Schorsch Anfang, Nina Blauwart, Michael Burkhart, Aurélie Chambert, Nathalie Chèvre, Anne Dietzel, Kathrin Fenner, Wolfgang Fischer, Martin Frey, Silvia Frey, Lukas Gasser, Monique Gehriger, Karin Ghilardi, Luciana Gomides, Christian Götz, Irene Hanke, Michel Haller, Ewenn Helary, Corinne Hörger, Maren Kahle, Christian Leu, Alfi Lück, Stephan Müller, Niccolo Hartmann, Daniel Huser, Jerome Krähenbühl, Andi Peter, José Benito Quintana Álvarez ‹Tito›, Maaike Ramseier, Merle Richter, Silke Richter, Matze Ruff, Manuel Schneider, Heinz Singer, Andi Spörri, Christoph Steiner, Christian Stamm, Sandra Stettler, Celine Tixier, Holger Tülp, Nathalie Valloton, Christopher Waul, Markus Wälle, Saskia Zimmermann.





Der grösste Dank gilt meiner Freundin Ulla-Maija Püllmann, die mich Tag und Nacht unterstützt hat. Lieben Dank für den Support und die Akzeptanz meiner Arbeit, insbesondere bezüglich Ausdauer bei den Sams- und Sonntagsprobenahmen – ‹Willi› sei Dank. Nicht zuletzt möchte ich mich bei meinen Liebsten bedanken. Sie haben mir über die ganzen Ausbildungsjahre einen starken Rückhalt gegeben und mich auf meinem Weg wohlwollend unterstützt.

Krispin Stoob Table of Contents

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Summary Antibiotics were discovered in the first half of the twentieth century as a miracle cure against bacterial infections. However, antibiotic resistance of microorganisms started to develop very soon. As a consequence, therapeutic options are narrowing and cases have been reported where bacteria have proven resistant against most antibiotic drugs known today. These pharmaceuticals are not only administered in human medicine but are an integral part of modern animal production. Because a part of these antibiotics is excreted as active drug, veterinary antibiotics can reach the environment by spreading manure of treated animals. Fluxes of several hundred grams of a single active ingredient per hectare and year can be expected to reach agricultural soils on intensive pig production farms. The role of these environmental residues with regard to the spread of resistant bacteria is not well understood today.

In this work, the fate of one important group of veterinary antibiotics – the sulfonamides – is investigated under natural weather conditions and typical Swiss agricultural practice. In the first phase of the project, methods for quantifying sulfonamides in soils and natural waters were developed to investigate the fluxes of theses substances in the environment. The water analysis was done by a fully automated coupling of solid phase extraction (SPE) and liquid chromatography – tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The developed approach allows efficient analysis of large numbers of samples with high precision. This was necessary to analyze the large number of samples needed to represent properly the spatial and temporal concentration variability that was observed. Pressurized liquid extraction followed by LC-MS/MS analysis was applied for the determination of the concentration in soil samples. High temperatures were the key parameter for an efficient extraction of sulfonamides from aged soil samples.

The fate of the sulfonamides was investigated by means of two controlled manure applications carried out on two grassland fields in the catchment of Lake Greifensee in spring 2003. The manure applied was delivered from an intensive pig farm outside the catchment and contained high concentrations of sulfonamides representing a worst-case scenario. The fate of the sulfonamides was dominated by an initial phase of fast dissipation of the substances during the first week following the manure applications. Later on, the dissipation slowed down resulting in soil residues of about 15% of the amount applied even 3 months after application.

For the transport to surface water the content of sulfonamides in pore water was more relevant than the extracted amount. Since the dissipation in Krispin Stoob Veterinary Sulfonamide Antibiotics in the Environment pore water was much faster than in the soil matrix, the period for losses to surface water was limited to a few weeks after application. The weather conditions following the two manure applications were quite different. The losses were an order of magnitude higher during wet conditions after the second application in May compared to the dry weather after the first one in March. Maximal peak concentrations up to 3.3 µg/L were determined in the brook during rain events.

Losses during wet conditions amounted to 0.6%, which was similar to those found for corn herbicides applied in the same catchment. Weather conditions right after application seemed to be even more crucial for the losses of sulfonamides compared to those of the corn herbicides. This was due to the fast dissipation in porewater and the pronounced (apparent) non-equilibrium between concentrations sorbed to the soil surfaces and concentration in the pore water.

Qualitative analysis of resistance genes in manure as well as in the soil of the field study revealed an input of resistance genes to the field. However, there was already a high prevalence of the analyzed genes prior to the manure application. After the spreading of the manure, the resistance genes were quite persistent in the soil. To date, it is not clear whether this persistence is influenced by the antibiotic residues in the soil or not.

In 2004, a monitoring campaign in the catchment of Lake Sempachersee, which is an intensive pig production area, confirmed the occurrence of the two most frequently used veterinary sulfonamide antibiotics in the two main tributaries of the lake. Residues could also be detected in the lake and ground water. However, the concentrations were very low, i.e., in the order of a few ng/L. The relevance of such trace concentrations remains an open question.

Zusammenfassung

Antibiotika wurden als Wunderheilmittel gegen bakterielle Infektionen in der ersten Hälfte des zwanzigsten Jahrhunderts entdeckt. Doch schon bald begannen Mikroorganismen Resistenzen gegen Antibiotika zu entwickeln. Als Folge davon verringerte sich die Auswahl an therapeutisch wirksamen Antibiotika und es wurden bereits Fälle rapportiert, bei welchen die Krankheitserreger gegen praktisch alle bekannten Medikamente resistent waren. Die pharmazeutischen Antibiotikaprodukte werden nicht nur in der Humanmedizin eingesetzt, sondern sind auch ein wesentlicher Bestandteil der modernen Nutztierhaltung.

Nach der Verabreichung wird ein Teil der Antibiotika als aktive Substanz von den Tieren wieder ausgeschieden und kann mit der Gülle in die Umwelt gelangen. Bei einer intensiven Masttierhaltung können Antibiotikaeinträge in die Umwelt mehrere hundert Gramm pro Hektar und Jahr betragen. Die Bedeutung dieser Antibiotikarückstände bezüglich der Verbreitung resistenter Bakterien in der Umwelt ist bis heute nur unvollständig verstanden.

In dieser Arbeit wird das Umweltverhalten einer wichtigen Gruppe von Veterinärantibiotika – den Sulfonamiden – unter natürlichen Bedingungen untersucht. In der ersten Phase des Projektes wurden Methoden für die Quantifizierung der Sulfonamide im Boden und im Wasser entwickelt, um damit die Stoffflüsse in der Umwelt untersuchen zu können. Für die Wasseranalyse wurde eine vollautomatisierte Festphasenextraktion (SPE) kombiniert mit einer Flüssigchromatographie – Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) entwickelt.

Diese Analysemethode erlaubt eine genaue Quantifizierung einer grossen Anzahl Proben innerhalb kurzer Zeit. Eine grosse Anzahl Messungen ist notwendig, um die räumliche und zeitliche Variabilität der Antibiotikakonzentration korrekt abzubilden. Zur Ermittlung der Konzentration im Boden wurde eine Analysemethode mit Flüssigextraktion unter hohem Druck gefolgt von einer LC-MS/MS-Analyse entwickelt. Bei gealterten Proben ist es dabei entscheidend, dass die Extraktion bei hohen Temperaturen stattfindet.

In einer im Frühling 2003 durchgeführten Feldstudie im Einzugsgebiet des Greifensees wurde das Verhalten der Sulfonamide im Feld mittels zweier Gülleversuche untersucht. Die verwendete Gülle stammte von einer intensiven Schweinmast ausserhalb des Untersuchungsgebiets. Die Sulfonamidkonzentration in der verwendeten Gülle war sehr hoch und stellte ein hohes, aber realistisches Belastungsszenario dar. Die erste Woche nach dem Gülleaustrag war geprägt von einem schnellen Rückgang der Sulfonamidkonzentration im Boden. Danach verlangsamte sich der Rückgang, jedoch konnten im Boden Krispin Stoob Veterinary Sulfonamide Antibiotics in the Environment selbst drei Monate nach der Güllung noch ungefähr 15% der ausgebrachten Menge nachgewiesen werden.



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