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«Expression, Reinigung und funktioneller Test von rekombinantem TNFR2-spezifischen TNF 1. Gutachter: Prof. Dr. Gesine Cornelissen (HAW Hamburg) 2. ...»

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Bachelorarbeit

Expression, Reinigung und funktioneller Test von

rekombinantem TNFR2-spezifischen TNF

1. Gutachter: Prof. Dr. Gesine Cornelissen (HAW Hamburg)

2. Gutachter: Prof. Dr. Daniela Männel (Universität Regensburg)

Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg

Fakultät Life Sciences

Department Biotechnologie

Abgabetermin: 11.06.2014

Eingereicht von

Christine Hirl

aus Regensburg

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1 Das Immunsystem

1.2 Cytokine und deren Rezeptoren

1.2.1 Allgemeines

1.2.2 Das TNF/TNFR-System

1.2.3 Die Rolle des TNF/TNFR-Systems im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen.......... 4

1.3 TNC-scTNF80

1.4 Ziel der Arbeit

2. Material

2.1 Verbrauchsmaterial und Geräte

2.2 Chemikalien, Reagenzien und Medien

2.3 Puffer und Lösungen

2.5 Kits

2.6 Software

2.7 Zelllinien

2.8 Antikörper

2. 9 Vektoren

3. Methoden

3.1 Zellkultur-Methoden

3.1.1 Bedingungen für das Arbeiten mit eukaryotischen Zelllinien

3.1.2 Zellkulturmedium

3.1.3 Kultur adhärent wachsender Zellen

3.1.4 Kultur von Suspensionszellen

3.1.5 Bestimmung der Lebendzellzahl

3.1.6 Gewinnen von Überstand aus der Zellkultur

3.2 Proteinbiochemische Methoden

3.2.1 Dialyse

3.2.2 PEG-Konzentrierung

3.2.3 Ammoniumsulfatfällung

3.2.4 Herstellen von Zelllysaten

3.2.5 BCA-Assay

3.2.6 SDS-PAGE

3.2.7 Coomassie-Färbung

3.2.8 Sypro Red Proteinfärbung

3.2.9 FLAG-Tag Affinitätschromatografie

3.3 Immunologische Methoden

3.3.1 Western Blot

3.3.2 ELISA

3.4 Molekularbiologische Methoden - Transfektion

4. Ergebnisse

4.1 Reinigung von TNC-scTNF80 aus HEK-scTNF80 Zellkulturüberstand

4.1.1 R1: Batch Adsorption – Desorption im gravity flow

4.1.2 R1 – Quantifizierung

4.1.3 R2 – Batch-Elution

4.1.4 R3 – Batch-Elution

4.1.5 R4 – Arginin-Elution

4.1.6 R4 – Quantifizierung

4.1.6 R5 – Arginin-Elution

4.1.7 Sypro Red Protein gel stain – Typhoon Scan

4.1.8 R6 – Batch-Elution

4.1.9 R7 – Batch-Elution

4.2 Konzentrierung des HEK-scTNF80 Zellkulturüberstandes

4.2.1 Ammoniumsulfatfällung

4.2.2 PEG-Konzentrierung

4.3 Bestimmung der biologischen Aktivität des gereinigten TNC-scTNF80 – IL-8 ELISA

4.3.1 IL-8 ELISA: R1, Ammoniumsulfatfällung und PEG-Konzentrierung

4.3.2 IL-8 ELISA der R3, R4 und R5

4.4 Anti-FLAG ELISA

4.5 Gewinnung von TNC-scTNF80 aus Ag8-Zellen

4.6 Transfektion von BFS-1 Zellen

5. Zusammenfassung der Ergebnisse, Diskussion und Ausblick

5.1 Reinigung des TNC-scTNF80

5.2 Konzentrierung der HEK-scTNF80 Zellkulturüberstände

5.3 Quantifizieren des TNC-scTNF80 im Zellkulturüberstand und den Eluaten

5.4 Aktivitätsbestimmung des TNC-scTNF80 durch den IL-8 ELISA

5.4 Gewinnung von scTNF80 aus Ag8-Zellen

5.5 Transfektion von BFS-1 Zellen

Literaturverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Danksagung

Eidesstattliche Erklärung

1. Einleitung

1.1 Das Immunsystem Mit einer Masse von 2-3 kg gehört das Immunsystem zu den großen Organen. Dies fällt allerdings nicht auf den ersten Blick auf, weil Immunzellen und lymphatische Gewebe im gesamten Organismus verteilt sind. Neben seiner Komplexität, weshalb das Immunsystem auch mit dem zentralen Nervensystem verglichen wird, ist eine beeindruckende Dynamik charakteristisch für dieses System: Zellteilung und Zelltod, Umbau der Organe durch Ein- und Auswanderung von Zellen, Veränderungen durch Differenzierung sind hier nicht die Ausnahme, sondern die Regel (Schütt, Bröker 2011).

Die physiologische Funktion des Immunsystems ist die Abwehr von Krankheitserregern. Aber auch nichtinfektiöse fremde Substanzen können eine Immunantwort auslösen. Dies geschieht in einer ersten Reaktion zunächst über das angeborene Immunsystem und als spätere Antwort über das adaptive Immunsystem (Abbas 2000).

Eine entscheidende Rolle für die Regulierung der Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems spielen Cytokine (Abbas 2000).

1.2 Cytokine und deren Rezeptoren 1.2.1 Allgemeines Cytokine sind lösliche Polypeptide mit lokaler Wirkung und einer kurzen Halbwertszeit von einigen Minuten. Das gleichzeitig an einem Ort wirkende Cytokinspektrum beeinflusst die dort vorhandenen Zellen und deren Funktion (Fischer 2011).

Die Cytokinnomenklatur ist nicht einheitlich, auch wenn viele als Interleukine mit einer eigenen Nummer bezeichnet werden. Sehr oft hängt die biologische Wirkung eines Cytokins davon ab, welche Rezeptorstruktur gebunden wird (Schütt, Bröker 2000).

Cytokine werden von Zellen des angeborenen und des adaptiven Immunsystems sezerniert und übernehmen eine Vielzahl von Funktionen in diesen Zellen. Cytokine werden als Antwort auf Krankheitserreger und andere Antigene produziert. Verschiedene Cytokine stimulieren dabei verschieden Antworten auf Zellen, die in der Immunabwehr und bei Entzündungsreaktionen involviert sind. In der Aktivierungsphase der adaptiven Immunantwort stimulieren Cytokine das Wachstum und die Differenzierung von Lymphocyten. In einer späteren Phase der angeborenen und adaptiven Abwehr aktivieren sie verschiedene Effektorzellen, um die Antigene zu eliminieren. In der Medizin spielen Cytokine deshalb eine wichtige Rolle in der Therapie, sowohl als Agonisten als auch als Antagonisten, in einer Vielzahl von Erkrankungen des Immunsystems und Erkrankungen, die mit einer Entzündung einhergehen (Abbas 2000).





1.2.2 Das TNF/TNFR-System Bisher wurden 40 Mitglieder der TNF-Cytokinfamilie identifiziert. Die Mitglieder des Tumornekrosefaktor (TNF)- und des TNF-Rezeptor (TNFR)-Systems spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung und Funktion des Immunsystems sowie der lymphoiden Organogense. Die Signalwege, welche durch die TNF- und TNFR-Familie reguliert werden, sind sehr unterschiedlich und beeinflussen unter anderem Zellproliferation, Zellüberleben, Differenzierung und Apoptose (Hehlgans, Pfeffer 2005). Die Liganden der TNF-Familie interagieren mit einem oder mehreren Rezeptortypen der TNFRFamilie und können verschiedene Zellantworten induzieren (Rauert 2012).

Eine wichtige Komponente der frühen angeborenen Immunantwort auf Viren und Bakterien ist die Sekretion von Cytokinen. Der Tumornekrosefaktor ist ein wichtiger Mediator akuter Entzündungen als Antwort auf gram-negative Bakterien und andere mikrobielle Antigene. TNF ist verantwortlich für zahlreiche systemische Komplikationen bei Infektionen. Seinen Namen hat der Tumornekrosefaktor seiner ursprünglichen Identifizierung als Serumfaktor, welcher Nekrose von Tumoren verursacht, zu verdanken. TNF wird auch als TNF-α bezeichnet, um es vom eng verwandten Lymphotoxin (TNF-ß) zu unterscheiden (Abbas 2000).

Die größte zelluläre Quelle des TNF sind aktivierte mononukleare Phagozyten. Aber auch antigenstimulierte T-Zellen, NK-Zellen und Mastzellen können dieses Protein sezernieren. Der potenteste Stimulus, um die TNF-Produktion durch Makrophagen zu erhöhen, ist TLR zusammen mit LPS und anderen bakteriellen Produkten. Große Mengen an TNF werden während einer Infektion mit gramnegativen Bakterien aufgrund von LPS in der bakteriellen Zellwand ausgeschüttet. IFN-γ, das von TZellen und NK-Zellen produziert wird, stimuliert die TNF-Synthese durch LPS-stimulierte Makrophagen zusätzlich (Abbas 2000).

In mononuklearen Phagozyten wird TNF als nichtglykosyliertes Typ II Membranprotein mit einem intrazellulären N-Terminus und einem großen extrazellulären Carboxylterminus synthetisiert.

Membran-TNF wird als Homotrimer exprimiert, welches in der Lage ist, an Typ II TNF-Rezeptoren zu binden. Der trimere Aufbau wird durch die TNF-Homologie-Domäne (THD) vermittelt, deren Aminosäuresequenz zwischen den Liganden der TNF-Familie zu etwa 25-30 % homolog ist. Die THD ist auch für die Bindung an die TNF-Rezeptoren verantwortlich (Rauert, 2012). Die etwa 150 Aminosäuren umfassende THD liegt carboxyterminal, also extrazellulär, und formt zwei ß-Faltblätter, welche eine jelly roll-Topologie bilden. Zwischen der THD und der Transmembrandomäne liegt eine stalk-Region.

Diese Region trägt eine Erkennungssequenz für Proteasen, welche die membranständigen Proteine prozessieren und somit lösliche Liganden freisetzen (Bodmer et al., 2002). Die Membranform des TNF wird durch membranassoziierte Metalloproteasen gespalten unter Freisetzung eines 17 kD Polypeptids. Drei dieser Polypeptidketten polymerisieren und formen das 51 kD, zirkulierende TNF Protein. Sezerniertes TNF bildet die Form einer dreiseitigen Pyramide aus, wobei jede Seite der Pyramide von einer Untereinheit geformt wird. Die Rezeptorbindestellen sind die Basis der Pyramide, was das Binden von parallel drei Rezeptormolekülen ermöglicht (Rauert 2012).

–  –  –

Es gibt zwei verschiedene TNF-Rezeptoren mit einem Molekulargewicht von 55 kD (TNF-RI) und 75 kD (TNF-RII). Die Affinität des TNFs zu seinen Rezeptoren ist für ein Cytokin ungewöhnlich niedrig. Die Kd für das Binden an TNF-RI beträgt nur ca. 1x10-9 und für TNF-RII 5x10-9. Die extrazelluläre Domäne der TNF-Rezeptoren ist durch sich wiederholende cysteinreiche Domänen (CRDs) charakterisiert, welche durch Disulfidbrücken stabilisiert werden. Die Bindung der Liganden an den Rezeptor findet im Bereich der CRDs statt (Locksley et al., 2001). Beide TNF-Rezeptoren sind in den meisten Zelltypen vorhanden.

Diese Rezeptoren liegen als Trimere gebunden auf der Plasmamembran vor. Cytokine, die an Mitglieder der TNF-Rezeptor Familie (z. B. TNF-RI, TNF-RII, CD40) binden, führen zu einer Rekrutierung von Proteinen, sog. TNF-Rezpetor assoziierte Faktoren (TRAFs), zur cytoplasmatischen Domäne des Rezeptors. Die TRAFs wiederum aktivieren Transkriptionsfaktoren, insbesondere nuclear factor kB (NFkB) und activation protein-1 (AP-1). Cytokine, die an andere Mitglieder der TNF-Rezeptor Familie binden, z. B. an TNF-RI, führen zur Rekrutierung von Adapterproteinen, die Caspase aktivieren und die Apoptose triggern. Dies zeigt, dass verschiedene Mitglieder der TNF-Rezeptor Familie sowohl Genexpression, als auch Zelltod oder sogar beides induzieren können (Abbas 2000).

Abbildung 2: Signalwege des TNFR2. Bindet TNF an TNFR2, induziert dies die Rekrutierung von TRAF2 und cIAP1/2. Die Aktivierung des IkK-Komplexes resultiert in der Induktion des NFkB-Signalweges. Zusätzlich wird PI3K über noch nicht bekannte molekulare Mechanismen aktiviert, welche auf TNFR2 zurückzuführen sind. Die aktivierte PI3K wandelt PIP2 in den second messenger PIP3 um, welcher PKB/AKT zur Plasmamembran rekrutiert, wodurch Phosphorylierung aktiviert wird. PKB/Akt aktiviert schließlich die NFkB Signalkaskade und induziert verschiedene zelluläre Überlebensmechanismen (Fischer 2011).

1.2.3 Die Rolle des TNF/TNFR-Systems im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen Eine wichtige Rolle des TNF/TNFR-Systems in Autoimmunerkrankungen, die häufig mit Entzündungsreaktionen einhergehen, konnte auf Anomalitäten im TNFR2 zurückgeführt werden.

Beispiele hierfür sind Polymorphismen im TNFR2-Gen, eine erhöhte Expression von TNFR2 und eine gesteigerte Abspaltung von TNFR2 in verschiedenen Autoimmunerkrankungen. Besonders Patienten mit beispielsweise familiärer rheumatoider Arthritis, die Polymorphismen im TNFR2 aufweisen, zeigen ein höheres Level an löslichem TNFR2, nicht aber an löslichem TNFR1. Dies ist vermutlich auf eine verstärkte Abspaltung der Ektodomäne des TNFR2 in den Extrazellulärraum zurückzuführen (Fischer 2011).

T-Zellen proliferieren und reifen im Thymus. Die meisten dieser unreifen Zellen sterben durch Apoptose während der T-Zell-Reifung. Dieser Prozess ist essentiell, um fehlerhafte Vorläuferzellen zu entfernen. Fehler in der T-Zell-Reifung können zu naiven autoreaktiven T-Zellen führen, die die Apoptose umgehen, in den Blutkreislauf einwandern und dort differenzieren durch den Kontakt mit spezifischen Eigen-Antigenen. Fehlerhafte T-Zell-Reifung kann zu einer Vielzahl von Autoimmunerkrankungen führen, beispielsweise Multiple Sklerose, Diabetes Typ I und Morbus Crohn (Fischer 2011).

Bei Diabetes Typ I beispielsweise handelt es sich um eine Form des Diabetes Mellitus, der auf einer Zerstörung der insulinproduzierenden ß-Zellen der Langerhansschen Inseln der Bauchspeicheldrüse aufgrund einer Autoimmunreaktion beruht. Das Fehlen von Insulin führt zu einer Hyperglykämie.

Manifestiert sich diese über einen längeren Zeitraum, hat dies Gefäßschädigungen einhergehend mit Nierenschäden, Herzerkrankungen, Retinopathie und Neuropathie zur Folge. Obwohl eine Insulinsubstitution Symptome und lebensbedrohliche Komplikationen reduziert, können Spätfolgen, die auf den Diabetes Typ I zurückzuführen sind, in vielen Fällen nicht verhindert werden. Typ I Diabetes kann durch fehlerhafte Prozessierung von Proteinen verursacht werden, die einen Fehler beim Zerstören autoreaktiver CD8+ T-Zellen während der physiologischen Reifung dieser Zellen zur Folge haben. Diese autoreaktiven T-Zellen können in den Blutkreislauf einwandern und zerstören bei Erreichen der Pankreas die insulinproduzierenden ß-Zellen. Eine Verabreichung von TNF in niedrigen Dosen führt zu einer gezielten Apoptose der pathogenen CD8+ T-Zellen, aber nicht zur Apoptose nichtpathogener T-Zellen. Dieser Effekt auf die pathogenen CD8+ T-Zellen ist auf verschiedene Defekte in der Aktivierung des NF-kBs zurückzuführen. Anti-apoptotische Effekte werden nicht länger vermittelt, stattdessen wird die Apoptose eingeleitet (Fischer 2011).

1.3 TNC-scTNF80

Das single chained (sc) TNF80 besteht aus 3 TNF-Monomeren, welche durch kurze Linker-Aminosäuren verbunden sind. Membrangebundenes TNF (memTNF) aktiviert, wie bereits erwähnt, sowohl TNFR1 als auch TNFR2. Um eine TNF-Variante als Therapeutikum verwenden zu können, muss diese sowohl das memTNF nachahmen, als auch selektiv den TNFR2 aktivieren.



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