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«Zusammenhänge zwischen computergestützt ermittelten spermatologischen Merkmalen und der Fertilität von Bullen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung ...»

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Aus der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken

-Klinik für kleine Klauentiereder Tierärztlichen Hochschule Hannover

Zusammenhänge zwischen computergestützt ermittelten

spermatologischen Merkmalen und der Fertilität von Bullen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

DOKTORS der VETERINÄRMEDIZIN

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Jens Baltissen

aus Nettetal

Hannover 2007

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. D. Waberski

1. Gutachterin: Prof. Dr. med. vet. D. Waberski

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H. Bollwein Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2007 Meinen Eltern gewidmet.

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 9 2 Literatur 10 2.1 Methoden zur Spermabeurteilung 10 2.1.1 Resistenztests 10 2.1.2 Computergestützte Methoden 11 2.1.2.1 Parameter der CASA 12 2.1.2.2 Entwicklung der CASA-Geräte 14 2.1.2.3 Computergestützte Morphometrie 16 2.1.2.4 Plasmamembranintegrität (SYBR 14 und PI) 17 2.1.3 Zusammenhänge zwischen den spermatologischen Parametern ………………und der Fruchtbarkeit 19 2.2 Überprüfung der Befruchtungskompetenz 25 2.2.1 Maßzahlen für die Fruchtbarkeit 25 2.2.1.1 Non-Return-Rate (NRR) 24 2.2.1.2 Heterospermer (kompetetiver) Index 26 2.2.1.3 Embryonen und akzessorische Spermien 27 2.2.2 Einflußfaktoren auf die Fruchtbarkeit 28 Inhaltsverzeichnis 3 Eigene Untersuchungen 34 3.1 Material und Methoden 34 3.1.1 Versuchsaufbau 34 3.1.2 Tiere 34 3.1.3 Samenproduktion 34 SpermVision® Gerät 3.1.4 35 3.1.5 Untersuchungsablauf 36 3.1.6 Vergleichsstudie der Messsysteme 39 3.1.7 Künstliche Besamung 39

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Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ALH Amplitude of lateral head displacement (µm) Beat cross frequency (s-1) BCF bzw. beziehungsweise ca. circa CASA Computer assisted sperm analysis d.h. das heißt DAP Distance avarage path (µm) DCL Distance curve line (µm) df degrees of freedom (Freiheitsgrade) DM Doppel- und Mehrfachmissbildungen DSL Distance straight line (µm) etc. et cetera gMOT Motilität, gesamt (%) H Halsveränderungen HE Veränderungen an Haupt- und Endstück K Kopfveränderungen KK Kopfkappenveränderungen LIN Linearity: VSL / VCL MAS Morphologisch abweichende Spermien Mio. Millionen Mrd. Milliarden MW arithmetischer Mittelwert n.s. nicht signifikant NRR Non-Return-Rate (%) o.a. oben angeführt p probability (Wahrscheinlichkeit) PI Propidiumiodid pMOT Motilität, progressiv (%) Abkürzungsverzeichnis SD Standardabweichung STR Straightness: VSL / VAP V Verbindungsstückveränderungen VAP Velocity avarage path (µm / sec) VCL Velocity curve line (µm / sec) vgl. vergleiche VIA Viability (Zellmembranintegrität) (% lebende Spermien) VK Variationskoeffizient VSL Velocity straight line (µm / sec) K Kopfveränderungen KK Kopfkappenveränderungen V Verbindungsstückveränderungen H Halsveränderungen MAS Morphologisch abweichende Spermien HE Haupt- und Endstückveränderungen WOB Wobble: VAP / VCL Einleitung

1 Einleitung

Die computergestützte Spermabeurteilung, „Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)“, ermöglicht eine objektive und standardisierbare Erfassung von Bewegungsparametern und Konzentrationen von Spermien. Der technische Fortschritt qualifiziert diese Systeme auch für den Einsatz auf den Besamungsstationen, wo sie zur Qualitätssicherung und Steigerung der Produktionseffizienz beitragen. Die CASA-Systeme ermöglichen eine Einzel-ZellAnalyse einer Fülle von Motilitäts- und Geschwindigkeitsparametern, deren fertilitätsdiagnostisches Potential weitgehend unbekannt ist.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, den Zusammenhang zwischen den mit dem CASASystem SpermVision® erhobenen Parametern sowie standard-spermatologischen Merkmalen und der Fertilität von Besamungsbullen bei Einsatz von Tiefgefriersperma herzustellen. Die vorliegende Studie zeichnet sich durch folgende Charakteristika aus: (1) die hohe Anzahl der Tiere und der untersuchten Ejakulate, (2) den direkten Zusammenhang zwischen dem untersuchten Sperma und der im Besamungsversuch ermittelten Fertilität, (3) der Verwendung eines technisch weiter entwickelten CASASystems mit dem es auch möglich ist, die Plasmamembranintegrität zu bestimmen und (4) die kombinierte Analyse von Motilitäts- und Morphologieparametern zur Fertilitätsprognose in einem linearen Regressionsmodell. Es wird erwartet, dass durch die Kombination aller oben genannten Faktoren die Prognose der Befruchtungskompetenz von Besamungsbullen und die Effizienz der Produktion von Tiefgefriersperma erhöht werden kann. Dabei wird im Speziellen die mögliche Identifikation subfertiler Bullen anhand spermatologischer Merkmale geprüft. Die frühzeitige, d.h. auf Laborebene stattfindende Erkennung dieser Bullen würde zu einer deutlichen Effizienzsteigerung in der Selektion und der Produktivität der Tiere und damit zu einer höheren Rentabilität führen.

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2.1 Methoden zur Spermabeurteilung Generell werden verschiedene Methoden zur Spermabeurteilung von Besamungsbullen unterschieden (WEITZE, 2001). Zu diesen zählen neben der grobsinnlichen Untersuchung die klassische Motilitäts- und Morphologiebestimmung.

Die Entwicklung computergestützter Analyseverfahren ermöglicht eine objektive Bestimmung von Motilität und Morphologie und die Messung zusätzlicher, die Kinetik einzelner Spermien beschreibende Parameter (BOYERS et al., 1989). Ergänzt werden diese durch funktionelle Tests einzelner spermatologischer Eigenschaften, zu denen unterschiedliche Resistenztestverfahren und neuartige fluoreszenzmikroskopische Färbetechniken zählen (WABERSKI et al., 1999).





2.1.1 Resistenztests

Ziel eines Resistenztests ist, die Reaktion der Spermien unter bestimmten Belastungen zu erfassen und somit Rückschlüsse auf die Qualität des Ejakulates zu schließen. Die Art der Belastung können Lagerung, Hitze und Kälte, pharmakologische Agenzien, osmotisch unterschiedliche Medien sowie oxidativer Stress sein (MULLER, 2000).

Beim Lagerungstest wird das Bullensperma mehrere Tage bei 5° gelagert und im C 24 h Rhythmus untersucht (WEITZE, 2001). Von ähnlichem Ablauf ist auch der Thermoresistenztest. Das aufgetaute Sperma wird bei Körpertemperatur für einige Stunden inkubiert und stündlich untersucht (WEITZE u. MÜLLER, 1991). SAACKE (1970) und SAACKE und WHITE (1970/1972) berichteten signifikante Beziehungen (r = 0,46; p 0,05; zwei Stunden nach Auftauen und Lagerung bei 38° zwischen C) der Motilität im Thermoresistenztests und der Non-Return-Rate (NRR) von sechzehn Bullen (158 Ejakulate). Diesen Zusammenhang stellten auch KOZUMPLIK und

Literatur

SOSNOVA (1985) bei 17 Bullen mit 160 Ejakulaten und 10682 Erstbesamungen dar.

Bei den Ejakulaten, die nach zwei Stunden Inkubation bei 38° noch 40% C progressive Motilität aufwiesen, konnte eine Abkalberate von 64,9% (1496 Besamungen) ermittelt werden. Bei 30% progressiver Motilität war diese mit 57,0% (2403 Besamungen) signifikant geringer.

Ein häufig angewendeter Resistenztest, der eine Aussage über die Funktion und die chemisch-physikalischen Aktivität der Plasmamembran zulässt (ENGLAND u.

PLUMMER, 1993), ist der Hypoosmotische-Schwelltest (HOST) (NIE u. WENZEL, 2001; LECHNIAK et al., 2002). Dabei wird die Fähigkeit der Plasmamembran, unterschiedliche osmotische Gradienten auszugleichen, getestet. Die kombinierte Analyse im Regressionsmodell von Ergebnissen des (hyper-)osmotischen Resistenztests und mittels CASA bestimmter Motilitätsdaten beim Schwein brachte signifikante Korrelationen zur Konzeptionsrate (QUINTERO-MORENO et al., 2004).

BRITO et al. (2003) stellten den Hyperosmotischen-Schwelltest als das einzige Verfahren heraus, das eine signifikante Aussage über die Funktion der Plasmamembran von Bullenspermien im Bezug auf die in-vitro-Fertilisationsrate gibt.

Sie empfahlen den Test in die Routineuntersuchung einzubeziehen. Korrelationen konnten auch zwischen einem Hypoosmotischen-Schwelltest und der Membranintegrität von Bullensperma (r = 0,45, p 0,05) sowie dem ATP Gehalt des Spermas (r = 0,61, p 0,05) gezeigt werden (JANUSKAUSKAS et al., 1996). In einer kombinierten Analyse der Membran von Kopf und Schwanz des Kaninchenspermiums durch Anfärbung mittels Eosin und einem HypoosmotischenSchwelltest fanden DUCCI et al. (2002) eine positive Korrelation zur Motilität.

Insgesamt lassen diese Ergebnisse die Annahme zu, dass die Resistenzfähigkeit von Sperma einen Beitrag zur Vorhersage der Befruchtungskompetenz leisten kann.

2.1.2 Computergestützte Methoden Die „Computer Assisted Sperm Analysis“ (CASA) hat sich in den letzten Jahren unter anderem durch die stetig steigende Rechenleistung der Personal Computer immer weiterentwickelt (HOLT, 1996). Dabei wurde mit diversen Systemen der Forderung

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nach objektiven Beurteilungsmöglichkeiten bei der spermatologischen Untersuchung Rechnung getragen. Neben der Bestimmung der Vorwärtsbeweglichkeit können zusätzlich Geschwindigkeit und Art der Bewegung ermittelt werden. Durch die deutliche Beschleunigung der Untersuchungen und die Kostenreduzierung der Geräte werden diese nun mehr nicht nur in wissenschaftlichen Einrichtungen verwendet (BOYERS et al., 1989), sondern auch für den Routinebetrieb der

Besamungsstationen interessant. Das Prinzip der Analyse hat sich nicht verändert:

Von dem zu untersuchenden Sperma wird mit einer Kamera, die auf einem Mikroskop angebracht ist, eine Videosequenz erstellt und mittels geeigneter Softwareprogramme analysiert. Das Programm gibt dabei Informationen für jedes einzelne in der Sequenz getroffene Spermium wieder und ist in der Lage, bei Benutzung einer Untersuchungskammer mit definiertem Volumen auch die Spermiendichte der Probe zu bestimmen. Durch die Ergänzung der Systeme um fluoreszenzmikroskopische Einheiten wurde es möglich, durch unterschiedliche Färbemethoden Aussagen über die Funktionalität der einzelnen Organellen des Spermiums, insbesondere der Plasmamembran- und der Akrosomintegrität zu treffen. Im Gegensatz zur subjektiven Beurteilung ergibt dies eine enorme Steigerung an Information und eine deutliche Minimierung der Untersuchungszeit (AGARWAL et al., 2003). Gleichzeitig lassen sich unterschiedliche Laboreinrichtungen besser qualitativ vergleichen (VERSTEGEN et al., 2001).

2.1.2.1 Parameter der CASA

Die üblicherweise von den CASA-Geräten gemessenen Parameter sind neben der lokalen, progressiven und nicht vorhandenen Motilität bestimmte Werte, die die Kinetik des einzelnen Spermiums detailliert beschreiben. Dazu gehören nach BOYERS et al. (1989) jeweils die Strecke und die Geschwindigkeit über den gesamten Weg, den das Spermium in der gemessenen Zeit zurückgelegt hat (DCL = distance curve line bzw. VCL = velocity curve line), die Strecke und die Geschwindigkeit über die direkte Verbindung zwischen Anfangs- und Endpunkt (DSL = distance straight line bzw. VSL = velocity straight line) und über den

Literatur

durchschnittlichen Weg (DAP = distance average path bzw. VAP = velocity average path). Die seitliche Kopfauslenkung (ALH = amplitude of lateral head displacement) beschreibt die Amplitude der Abweichung des Kopfes vom durchschnittlichen Weg.

Die beat-cross frequency (BCF) ist die gemittelte Frequenz, mit der die Bahn der gesamten vom Spermium zurückgelegten Strecke die durchschnittliche Strecke kreuzt. Aus diesen gemessenen Werten können weitere Parameter errechnet werden. Dazu zählt die Linearity (LIN), der Quotient aus VSL durch VCL, der die Linearität über die gesamte Strecke wiedergibt. Die Straightness (STR), VSL durch VAP, gibt die Geradlinigkeit des durchschnittlichen Weges wieder. Außerdem beschreibt der Wobble (WOB) den Grad des Ausschlags der gesamten Strecke von der gemittelten Strecke. Die hier genannten Parameter sind in Abbildung 1 zusammengefasst dargestellt. BOYERS et al. (1989) geben zu den aufgelisteten Parametern eine detaillierte Erläuterung.

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2.1.2.2 Entwicklung der CASA-Geräte Die Entwicklung der CASA-Geräte beinhaltete eine stetige technische Verbesserung der Messung und der Datenerfassung. Nach HOLT und VAN LOOK (2004) sind die Stör- und Fehlerquellen der ersten Untersuchungen bei der Benutzung der Systeme weitgehend überwunden. Ein Punkt, der in allen Studien als problematisch beschrieben wird, ist die Handhabung der Proben. DAVIS et al. (1995) geben als limitierende Faktoren für eine präzise Messung die Temperatur, die Messkammerbeschaffenheit, die Anzahl der untersuchten Bilder und den Zeitpunkt der Messung an. Gerade die Kammer spielt beim Messvorgang eine entscheidende Rolle. Unterschiedliche Beschickung oder geringe Volumenschwankungen, z. B.

durch Luftblasen oder uneinheitliche Produktionschargen seitens des Herstellers, führen zu abweichenden Ergebnissen. GINSBURG et al. (1990) fanden in ihren Untersuchungen über den Einfluss von Kammerdesign und –tiefe deutliche Unterschiede zwischen Makler-, Neubauer- und MicroCell- Kammern in der Präzision und Wiederholbarkeit der Ergebnisse, wobei Makler-Kammern die geringste Wiederholbarkeit aufwiesen. Neben den Schwankungen in der Konzentration wichen auch die Durchschnittsgeschwindigkeiten der Spermien zwischen den Messsystemen voneinander ab. Der Grund ist in der Kammertiefe zu suchen.

Während die Spermien sich im dreidimensionalen Raum bewegen, misst das CASA System nur zweidimensional. Eine geringe Kammertiefe ist also Vorraussetzung dafür, dass die Spermien sich in einer Ebene bewegen, da ansonsten die zurückgelegte Strecke zu gering eingeschätzt wird. Dies wird durch eine Studie von SCHRÖTER et al. (1996) belegt, die signifikante Unterschiede der VAP zwischen einer 10 µm und einer 15 µm tiefen Kammer fand. Die Geschwindigkeit war in der flachen Kammer höher als in der tieferen Modellausführung. Den Einfluss des SegreSilberberg Effektes führt NICOLAE (2006) außerdem in seinen Untersuchungen an Ebersperma als mögliche Ursache einer uneinheitlichen Verteilung innerhalb einer Messkammer an. Er fand bei der Benutzung der Leja-Kammer und SpermVision® für die Messungen im Bereich zwischen 5 mm und 12 mm (Konzentration) und zwischen

Literatur

7 mm und 11 mm (Motilität) vom Rand entfernt die geringsten Variationskoeffizienten.



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