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«DISSERTATION zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg (Dr. rer. nat.) ...»

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Gentherapie der Rheumatoiden Arthritis mit

foamyviralen Vektoren

DISSERTATION

zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg (Dr. rer. nat.)

vorgelegt von

Dipl. Biochem. Nicole Armbruster

aus Marbach am Neckar

Würzburg, 2011

Erklärung

Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die Dissertation „Gentherapie der Rheumatoiden

Arthritis mit foamyviralen Vektoren“ selbständig angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Zudem erkläre ich, dass diese Dissertation weder in gleicher noch in anderer Form bereits in einem Prüfungsverfahren vorgelegen hat.

Ich habe früher außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten Graden keine weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.

Würzburg, den 26.07.2011 Nicole Armbruster Eingereicht am:

Mitglieder der Promotionskommission

Vorsitzender:

Gutachter: Prof. Dr. Axel Rethwilm Gutachter: Prof. Dr. Georg Krohne Tag des Promotionskolloquiums: ………………………….…………….

Doktorurkunde ausgehändigt am: ……………………….……………… Danksagung Ich möchte mich zunächst bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Axel Rethwilm bedanken, der es ermöglicht hat, dass diese Dissertation unter seiner Betreuung am Institut für Virologie Universität Würzburg angefertigt werden konnte. Ich danke Ihm sehr herzlich für die Bereitstellung des Themas, die freundliche Unterstützung und sein ständiges Interesse und seine Diskussionsbereitschaft, die den Fortgang meiner Arbeit stets begleitet und gefördert haben.

Ebenfalls bedanke ich mich bei Prof. Dr. Georg Krohne für die Übernahme des Zweitgutachtens.

Ich möchte mich ganz besonders bei PD Dr. Andre Steinert für die Betreuung meiner wissenschaftlichen Arbeit bedanken. Stets hat er meine Arbeit mit Interesse, freundlicher Unterstützung sowie Geduld begleitet und so für ein sehr angenehmes und produktives Arbeitsklima gesorgt.

Weiterhin danke ich PD Dr. Carsten Scheller für die praktische Betreuung dieser Arbeit, die freundliche Hilfsbereitschaft während der experimentellen Phase und dem Verfassen dieser Arbeit und die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe.

Ich danke allen Mitgliedern des Instituts für Virologie und Immunbiologie sowie allen Mitarbeitern des Orthopädischen Zentrum für Muskuloskelettale Forschung (ZMF, KönigLudwig-Haus, Würzburg) für ihre Hilfsbereitschaft und eine angenehme Arbeitsatmosphäre.

Mein weiterer Dank gilt allen anderen Mitarbeitern der Arbeitsgruppen Scheller, Koutsilieri, Steinert und Rethwilm für ihre Hilfsbereitschaft. Insbesondere bedanke ich mich bei Kathrin, Tatiana, Bianca, Falko, Jennifer, Anne, Inge, Christa, Conrad, Daniel, Uwe, und Manuela für ihre unermüdliche Hilfs- und Diskussionsbereitschaft, die vielen Ratschläge und ein sehr freundliches Arbeitsklima.

Nicht zuletzt bedanke ich mich von ganzem Herzen bei meiner Familie, Micha und seiner Familie und meinen Freunden, die mich in jeglicher Hinsicht unterstützt und gefördert haben.

–  –  –

Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung

1.1 Zusammenfassung

1.2 Summary

2 Einleitung

2.1 Rheumatoide Arthritis

2.1.1 Definition und Epidemiologie

2.1.2 Gelenkaufbau

2.1.3 Pathogenese

2.2 Interleukin-1

2.3 Interleukin-1 Rezeptorantagonist, IL1RA

2.4 Behandlung der RA

2.5 Gentherapie

2.6 Gentherapie der Rheumatoiden Arthritis

2.7 Foamyviren

2.7.1 Definition

2.7.2 Genomorganisation und Morphologie

2.7.3 Foamyvirale Vektoren

2.7.4 Gentherapie mit FV-Vektoren

2.8 Fragestellung

3 Material

3.1 Geräte

3.2 Material

3.3 Chemikalien

3.4 Computerprogramme und Internetseiten

3.5 Enzyme und Reaktionspuffer

3.6 Reaktionskomplettausstattungen (Kits)

3.7 Größenstandards

–  –  –

3.8 Puffer und Lösungen

3.9 Medien

3.10 Bakterienstämme

3.11 Zelllinien

3.12 Vektorplasmide

3.13 Primer und Oligonukleotide

4 Methoden

4.1 Zellbiologische Methoden

4.1.1 Kultivierung adhärenter Zellen

4.1.2 Auftauen und Einfrieren von Zellen

4.1.3 Transfektion von eukaryotischen Zellen mittels Polyethylenimin (PEI) zur Produktion foamyviraler Partikel

4.1.4 Herstellung virushaltiger Überstände

4.1.5 Transduktion von Zielzellen mit FV-Vektorpartikeln

4.1.6 Fluoreszenzmikroskopie

4.1.7 Durchflusszytometrie (FACS-Analyse)

4.1.8 Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

4.2 Mikrobiologische Methoden

4.2.1 Kultivierung von Bakterien in Flüssigkulturen

4.2.2 Herstellung kompetenter E. coli Bakterien

4.2.3 Anlegen von Glycerinkulturen

4.2.4 Transformation

4.3 Molekularbiologische Methoden

4.3.1 RNA Isolation aus eukaryotischen Zellen





4.3.2 Klonierung von DNA-Fragmenten

4.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)

4.3.4 Reverse Transkriptions (RT)-PCR (cDNA-Synthese)

4.3.5 Reinigung von PCR-Produkten

4.3.6 Isolierung und Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen..........60 4.3.7 Agarosegelelektrophorese von Nukleinsäuren

4.3.8 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien

4.3.9 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

4.3.10 Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen

4.3.11 Dephosphorylierung

INHALTSVERZEICHNIS

4.3.12 Ligation

4.4 Proteinbiochemische Methoden

4.4.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

4.4.2 PGE2-Assay

4.5 3D-Pelletkulturen / Chondrogene Differenzierung in vitro

4.6 Kultivieren von hMSZ

4.6.1 Transduktion von hMSZ mit FV-Vektoren

4.6.2 Chondrogene Differenzierung von hMSZ in der Pelletkultur

4.6.3 Paraffineinbettung von Pellets

4.6.4 Herstellung von Paraffinschnitten und Entparaffinierung

4.6.5 Hämalaun&Eosin (H&E) Färbung

4.6.6 Alcianblau Färbung

4.7 Tierexperimentelle Arbeiten

4.7.1 Haltung der Tiere und verwendete Rattenstämme

4.7.2 Anästhesie, Operation und Postoperative Versorgung

4.7.3 Präparation von Synovialmembranen aus Rattenkniegelenken

4.7.4 Organentnahme

4.7.5 Isolierung genomischer DNA (gDNA) aus Geweben

4.7.6 Organkulturen

4.8 Quantitative Analyse und Statistik

5 Ergebnisse

5.1 Konzentrierung FV-Vektoren durch Zentrifugation

5.2 Klonierung von pBF014 (IRES-EGFP):

5.3 Klonierung und Charakterisierung des Vektors NA4 (pBF014-EF-1α).................75

5.4 Klonierung und Charakterisierung des Vektors NA3 (hIL1β in SJ03)

5.5 Klonierung und Charakterisierung des Vektors NA2 (ratIL1RA in BF014)...........78

5.6 In vitro Evaluierung des FV.hIL1RA / NA1 Vektors (hIL1RA in BF014)...............81 5.6.1 In vitro Charakterisierung des FV.hIL1RA Vektors mit primären Ratten Synovialfibroblasten

5.6.2 In vitro Funktionalität von hIL1RA

5.6.3 Langzeitexpression von FV.hIL1RA in MSZ

–  –  –

5.6.4 NA1-transduzierte Zellen überwinden die IL1β-induzierte Blockade der chondrogenen Differenzierung

5.7 FVV vermittelte Transgenexpression in vivo

5.7.1 Experimentelles Design der Gentransferstudien

5.7.2 Zellkulturen von explantierten Synovialzellen

5.7.3 In Vivo Expression von humanem IL1RA in Wistar Ratten

5.7.4 In Vivo Expression von humanem IL1RA in nude Ratten

5.7.5 Biodistribution

6 Diskussion

6.1 FVV für die Gentherapie der RA

6.2 In vitro Charakterisierung und Aufbau der Foamyviralen Vektorkonstrukte.......108

6.3 Zellbasierter foamyviral vermittelter Gentransfer in Rattenkniegelenke.............113

6.4 Therapiesicherheit

6.5 Experimentelle Arthritismodelle

6.6 Foamyvirale Transduktion von humanen mesenchymalen Stammzellen...........122

6.7 FV.hIL1RA Langzeitexpression in MSZ

6.8 Ausblick

7 Anhang

7.1 Detaillierte Angaben zu den i.a. hIL1RA-Messungen

7.2 Abbildungsverzeichnis

7.3 Tabellenverzeichnis

7.4 Abkürzungsverzeichnis

7.5 Publikationsliste

8 Literaturverzeichnis

–  –  –

1 Zusammenfassung

1.1 Zusammenfassung Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch anhaltende Gelenksentzündungen gekennzeichnet ist und mit einer fortschreitenden Degradierung des Knorpels und Knochen einhergeht. Ungefähr 2 % der erwachsenen Bevölkerung weltweit sind betroffen und leiden unter erheblichen Gelenkschmerzen und Beeinträchtigungen.

Der intraartikuläre Transfer anti-entzündlicher Gene (z.B. des Interleukin-1 Rezeptorantagonisten – IL1RA) zeigte signifikante Bedeutung in präklinischen und Phase-I klinischen Studien der RA Therapie. Die meisten dieser Studien verwendeten MLV-basierte orthoretrovirale Vektoren für eine stabile Transgenexpression, tragen aber das Risiko der Insertionsmutagenese.

Wir haben foamyvirale Vektoren (FVV) etabliert, welche von apathogenen Elternviren abgeleitet sind und sich durch ein breites Wirtsspektrum und ein vorteilhaftes Integrationsmuster ins zelluläre Genom auszeichnen. In dieser Arbeit wurden IL1RA exprimierende prototypische foamyvirale Vektoren (PFV) generiert, deren chondroprotektives Potential in vitro und in einem indirekten Gentransferansatz in Kniegelenken von Wistar und athymischen Nacktratten in vivo evaluiert wurde.

PFV Vektoren mit der kodierenden Sequenz für den humanen IL1RA, einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und EGFP wurden generiert und mit Verwendung eines Vier-Plasmidsystem, bestehend aus dem Vektorplasmid (IL1RA-IRES-EGFP) und den Expressionsplasmiden FV-gag, FV-pol und FV-env in 293T Zellen produziert. Ebenso wurden Kontrollvektoren welche nur EGFP exprimieren generiert.

Transduktionsexperimente wurden mit primären humanen mesenchymalen Stammzellen (MSZ) aus Knochenmarkaspiraten, der Tert-4 mesenchymalen Stammzelllinie, HT1080 Fibroblasten und primären Ratten Synovialfibroblasten durchgeführt. Die Transgenexpression wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (EGFP), ELISA (IL1RA) und quantitativer Real-Time PCR (IL1RA) evaluiert.

Die Funktionalität des IL1RA-Proteins wurde mit einem Prostaglandin E2 (PGE2) Assay gezeigt. Dazu wurden FV.IL1RA transduzierte Tert-4 Zellen und unbehandelte Zellen mit 10 ng/ml IL1β inkubiert. Als readout für die IL1-Stimulation dienten die PGE2 Mengen in den konditionierten Medien. Die Zellkulturüberstände wurden 48 h nach IL1-Gabe auf ihren PGE2 und IL1RA Gehalt hin untersucht. Die PGE2 Menge war dabei, im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen, in den FV.IL1RA transduzierten Zellen signifikant erniedrigt.

Nach der Transplantation von foamyviral transduzierten Synovialfibroblasten in Kniegelenke von Wistar und athymischen Nacktratten, war die intraartikuläre (i.a.) Transgenexpression in

ZUSAMMENFASSUNG

den Wistar Ratten zunächst hoch, fiel jedoch nach ungefähr 3 Wochen ab. Im Gegensatz dazu war die foamyviral vermittelte IL1RA-Expression in den immundefizienten Ratten für 12 Wochen auf sehr hohen Leveln stabil. Ein Maximum wurde an Tag 10 nach i.a.

Transplantation mit ca. 450 ng pro Gelenk erreicht.

Untersuchungen zur Biodistribution zeigten keine extraartikuläre Transgenexpression in allen untersuchten Organen (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz, Gonaden und Serum).

Diese Resultate, zusammen mit dem Ausbleiben von sekundären Erkrankungen, wie bspw.

Tumoren, in allen behandelten Tieren, sprechen für die Sicherheit des Ansatzes.

Die Arbeit zeigt, dass FVV verwendet werden können, um primäre Synovialfibroblasten und MSZ effizient mit Markergenen und dem anti-entzündlichen IL1RA Transgen zu transduzieren. Die dabei erzielten Transgenlevel sind in der Lage, die Effekte von hochdosiertem IL1 zu blockieren.

Die Ergebnisse sprechen dafür, dass FVV sehr effiziente Werkzeuge für den ex vivo Gentransfer sind und unterstreichen ihr großes Potential für die Bereitstellung antientzündlicher Transgene in primären Zellen und Geweben.

Zukünftig soll diese Technologie in Tiermodellen der Arthritis angewendet werden. Das Fernziel der Arbeiten besteht in der Etablierung und Evaluierung eines Gentransfersystems, welches die in vivo Applikation am Menschen erlaubt.

1.2 Summary Rheuamtoid arthritis (RA) is an autoimmune disease with persistent joint inflammation that results in progressive degradation of cartilage and bone. Approximately 2 % of the adult population worldwide are estimated to be affected by RA and suffer from substantial joint pain and disability.

The intra-articular transfer of anti-inflammatory genes (e.g. interleukin receptor antagonist protein – IL1RA) showed significant impact in preclinical and early phase clinical trials for RA therapy. Most of these studies used MLV-based orthoretroviral vectors for stable transgene expression, but carry the risk of insertional mutagenesis. We have established foamyviral vectors (FVV) that are derived from apathogenic parent viruses and are characterized by a broad host range and a favourable integration pattern into the cellular genome. Here we used prototype foamyvirus vectors (PFV) that expressed IL1RA and evaluated their protective effects in vitro and in an indirect gene transfer approach in knee joints of Wistar and athymic nude rats in vivo.

PFV vectors carrying the coding sequence of the human IL1RA gene, along with EGFP (enhanced green fluorescent protein) linked via an internal ribosomal entry site (IRES), were generated and produced by using a four-plasmid system consisting of the vector plasmid

ZUSAMMENFASSUNG

(IL1RA-IRES-EGFP) and the expression plasmids FV-gag, FV-pol and FV-env in 293T cells.



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