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«Gisa Almut Juliane Althoff INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der ...»

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Untersuchungen zur immunhistologischen Darstellung

+

von CD8 T-Lymphozyten in paraffineingebettetem,

lymphatischem Gewebe der Katze

Gisa Almut Juliane Althoff

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet.

beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen

édition scientifique

VVB LAUFERSWEILER VERLAG

Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt.

Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme.

1. Auflage 2012 All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior written permission of the Author or the Publishers.

1st Edition 2012 © 2012 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Printed in Germany édition scientifique

VVB LAUFERSWEILER VERLAG

STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 email: redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de Aus dem Institut für Veterinär-Pathologie der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. M. Reinacher Untersuchungen zur immunhistologischen Darstellung von CD8+ T-Lymphozyten in paraffineingebettetem, lymphatischem Gewebe der Katze

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet.

beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von Gisa Almut Juliane Althoff Tierärztin aus Krefeld Gießen 2012 Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. M. Kramer Gutachter: Prof. Dr. M. Reinacher Prof. Dr. C. Staszyk Tag der Disputation: 7. August 2012 Meinen Eltern und in memoriam Ingrid Karber Ich erkläre: Ich habe die vorgelegte Dissertation selbständig und ohne unerlaubte fremde Hilfe und nur mit den Hilfen angefertigt, die ich in der Dissertation angegeben habe.Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nicht veröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze der wissenschaftlichen Praxis, wie sie in der „Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten.

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung

2 Literaturübersicht

2.1 Immunhistologie

2.1.1 Bedeutung und Einsatzgebiete

2.1.2 Leukozytendifferenzierungsantigene

2.1.3 CD8 - Charakterisierung und Bedeutung des immunhistologischen Nachweises

2.2 Gewebefixierung

2.2.1 Grundlagen

2.2.2 Herkömmliche Fixierungsmethoden

2.2.2.1 Formalinfixierung

2.2.2.1.1 Einführung

2.2.2.1.2 Maskierung von Antigenen - chemische Grundlagen

2.2.2.1.3 Antigen Retrieval

2.2.2.2 Gefrierschnitttechnik

2.2.3 Interessenkonflikt bei der Gewebefixierung

2.2.4 Alternative Fixierungsmethoden

2.2.4.1 Zielsetzung

2.2.4.2 Lösungsansätze

2.2.4.3 ZSF-Fixierung

2.2.4.3.1 Einführung

2.2.4.3.2 Wirkungsprinzip

2.2.4.3.3 Literaturübersicht über die Verwendung der ZSF-Fixierung...... 21 2.2.4.3.3.1 Immunhistologie

2.2.4.3.3.1.1 Probenspektrum

2.2.4.3.3.1.2 Nachweis von Leukozytenoberflächenantigenen

2.2.4.3.3.1.3 Nachweis von CD8

2.2.4.3.3.1.4 Antigen-Retrieval

2.2.4.3.3.2 Zytologie

2.2.4.3.3.3 Histologie

2.2.4.3.3.3.1 Morphologieerhalt

2.2.4.3.3.3.2 Spezialfärbungen

2.2.4.3.3.4 Molekularbiologie

I Inhaltsverzeichnis

2.2.4.3.3.5 Modifizierung der Methode

2.2.4.4 HOPE®-Fixierung

2.2.4.4.1 Einführung

2.2.4.4.2 Wirkungsprinzip

2.2.4.4.3 Literaturübersicht über die Verwendung der HOPE®Fixierung

2.2.4.4.3.1 Immunhistologie

2.2.4.4.3.1.1 Probenspektrum

2.2.4.4.3.1.2 Nachweis von Leukozytenoberflächenantigenen

2.2.4.4.3.1.3 Nachweis von CD8

2.2.4.4.3.1.4 Antigen-Retrieval

2.2.4.4.3.2 Zytologie

2.2.4.4.3.3 Histologie

2.2.4.4.3.3.1 Morphologieerhalt

2.2.4.4.3.3.2 Spezialfärbungen

2.2.4.4.3.4 Molekularbiologie

3 Material und Methoden

3.1 Untersuchungsmaterial

3.2 Vorberichte

3.3 Herstellung von Gewebeblöcken

3.3.1 Herstellung von Gefrierblöcken

3.3.2 Herstellung von formalinfixiertem, paraffineingebettetem Material

3.3.3 Herstellung von HOPE®-fixiertem, paraffineingebettetem Material

3.3.3.1 Fixierung

3.3.3.2 Prozessierung

3.3.4 Herstellung von ZSF-fixiertem, paraffineingebettetem Material

3.3.4.1 Fixierung

3.3.4.2 Prozessierung

3.3.4.2.1 Modifizierung des von Beckstead (1994) publizierten Protokolls

3.3.4.2.2 Prozessierung im Gewebeeinbettungsautomaten nach modifiziertem Protokoll





II Inhaltsverzeichnis

3.3.4.2.3 Manuelle Prozessierung nach dem Protokoll von Beckstead (1994)

3.4 Immunhistologische Untersuchung

3.4.1 Aufbereitung der Gewebeblöcke für die immunhistologische Untersuchung....... 42 3.4.1.1 Gefrierblöcke

3.4.1.2 Paraffinblöcke mit formalinfixiertem Material

3.4.1.3 Paraffinblöcke mit HOPE®-fixiertem Material

3.4.1.4 Paraffinblöcke mit ZSF-fixiertem Material

3.4.1.4.1 Im Gewebeeinbettungsautomaten prozessierte Proben............... 44 3.4.1.4.2 Manuell prozessierte Proben (ZSF-M)

3.4.2 Seren und Antiseren

3.4.2.1 Seren

3.4.2.2 Antiseren

3.4.2.2.1 Primärantikörper

3.4.2.2.2 Sekundärantikörper

3.4.2.2.3 Tertiärantikörper

3.4.3 Immunhistologischer Nachweis von CD8

3.4.3.1 Immunhistologischer Nachweis von CD8 in Gefriermaterial

3.4.3.2 Immunhistologischer Nachweis von CD8 in formalinfixiertem Material

3.4.3.3 Immunhistologischer Nachweis von CD8 in HOPE®-fixiertem Material

3.4.3.4 Immunhistologischer Nachweis von CD8 in ZSF-fixiertem Material....... 51 3.4.4 Immunhistologische Kontrollen

3.4.5 Auswertung

3.4.5.1 Immunhistologischer Nachweis von CD8

3.4.5.2 Beurteilungsverfahren

3.4.5.2.1 Ermittlung der optimalen Gebrauchsverdünnung des Primärantikörpers in Abhängigkeit von der jeweiligen Fixierungstechnik

3.4.5.2.2 Vergleich von Formalin-, HOPE®- und ZSF-fixiertem Gewebe mit Gefriermaterial hinsichtlich der immunhistologischen Darstellung von CD8

III Inhaltsverzeichnis

3.4.5.2.3 Einfluss der Fixierungsdauer auf den Antigenerhalt in HOPE®- und ZSF-fixiertem Material

3.4.5.2.4 Einfluss der Modifizierung des Prozessierungsprotokolls auf den Antigenerhalt bei der ZSF-Fixierung

3.4.5.2.4.1 Vergleich von nach modifiziertem Protokoll im Gewebeeinbettungsautomaten prozessiertem, ZSF-fixiertem Material mit manuell nach dem Protokoll von Beckstead (1994) prozessiertem ZSF-M Material

3.4.5.2.4.2 Vergleich von manuell nach dem Protokoll von Beckstead (1994) prozessiertem ZSF-M Material unterschiedlicher Paraffinierungsdauer

3.4.5.2.5 Einfluss der Entparaffinierung und Rehydierung auf den Antigenerhalt in HOPE®-fixiertem Material

4 Ergebnisse

4.1 Immunhistologie

4.1.1 Ermittlung der optimalen Gebrauchsverdünnung des Primärantikörpers in Abhängigkeit von der jeweiligen Fixierungstechnik

4.1.1.1 Gefriermaterial

4.1.1.2 Formalinfixiertes Material

4.1.1.3 HOPE®-fixiertes Material

4.1.1.4 ZSF-fixiertes Material

4.1.2 Bewertung des immunhistologischen Nachweises von CD8+ T-Lymphozyten in Formalin-, HOPE®- und ZSF-fixiertem Material im Vergleich zu Gefriermaterial

4.1.2.1 Gefriermaterial

4.1.2.2 Formalinfixiertes Material

4.1.2.3 HOPE®-fixiertes Material

4.1.2.4 ZSF-fixiertes Material

4.1.3 Bewertung des Einflusses der Fixierungsdauer auf den Antigenerhalt bei den alternativen Fixierungstechniken

4.1.3.1 HOPE®-fixiertes Material

4.1.3.2 ZSF-fixiertes Material

IV Inhaltsverzeichnis

4.1.4 Bewertung des Einflusses der Modifizierung des Prozessierungsprotokolls auf den Antigenerhalt bei der ZSF-Fixierung

4.1.4.1 Einfluss der Prozessierung im Gewebeeinbettungsautomaten nach modifiziertem Protokoll

4.1.4.2 Einfluss der Paraffinierungsdauer bei der manuellen Prozessierung nach dem Protokoll von Beckstead (1994)

4.1.5 Bewertung des Einflusses der Entparaffinierung und Rehydrierung auf den Antigenerhalt in HOPE®-fixiertem Material

4.1.6 Immunhistologische Kontrollen

4.2 Morphologieerhalt

4.2.1 Gefriermaterial

4.2.2 Formalinfixiertes Material

4.2.3 HOPE®-fixiertes Material

4.2.4 ZSF-fixiertes Material

5 Diskussion

5.1 Immunhistologie

5.1.1 Eignung der Fixierungsmethoden für die immunhistologische Darstellung von CD8+ T-Lymphozyten in felinem, lymphatischem Gewebe

5.1.1.1 Herkömmliche Methoden

5.1.1.1.1 Gefrierschnitttechnik

5.1.1.1.1.1 Ergebnisse der Reihenuntersuchung

5.1.1.1.1.1.1 Analyse negativer Nachweise

5.1.1.1.1.1.2 Erhaltungszustand Ausgangsmaterial........... 91 5.1.1.1.1.2 Antigenerhalt

5.1.1.1.1.3 Fazit

5.1.1.1.2 Formalinfixierung

5.1.1.1.2.1 Ergebnisse der Reihenuntersuchung

5.1.1.1.2.1.1 Analyse negativer Nachweise

5.1.1.1.2.1.2 Erhaltungszustand Ausgangsmaterial........... 93 5.1.1.1.2.2 Antigenerhalt

5.1.1.1.2.3 Fazit

5.1.1.2 Alternative Fixierungsmethoden

5.1.1.2.1 HOPE®-Fixierung

5.1.1.2.1.1 Ergebnisse der Reihenuntersuchung

V Inhaltsverzeichnis

5.1.1.2.1.1.1 Analyse negativer Nachweise

5.1.1.2.1.1.2 Erhaltungszustand Ausgangsmaterial........... 95 5.1.1.2.1.2 Einfluss der Fixierungsdauer

5.1.1.2.1.3 Einfluss der Entparaffinierung und Rehydrierung....... 98 5.1.1.2.1.4 Antigenerhalt

5.1.1.2.1.5 Fazit

5.1.1.2.2 ZSF-Fixierung

5.1.1.2.2.1 Ergebnisse der Reihenuntersuchung

5.1.1.2.2.1.1 Analyse negativer Nachweise

5.1.1.2.2.1.2 Erhaltungszustand Ausgangsmaterial......... 102 5.1.1.2.2.1.3 Uneinheitliche Anfärbung

5.1.1.2.2.2 Einfluss der Fixierungsdauer

5.1.1.2.2.3 Einfluss des Prozessierungsprotokolls

5.1.1.2.2.3.1 Einfluss der modifizierten Prozessierung im Gewebeeinbettungsautomaten............... 106 5.1.1.2.2.3.2 Einfluss der Paraffinierungsdauer............... 109 5.1.1.2.2.4 Antigenerhalt

5.1.1.2.2.5 Fazit

5.1.2 Immunhistologische Kontrollen

5.2 Morphologieerhalt

5.2.1 Herkömmliche Methoden

5.2.1.1 Gefrierschnitttechnik

5.2.1.2 Formalinfixierung

5.2.2 Alternative Methoden

5.2.2.1 HOPE®-Fixierung

5.2.2.2 ZSF-Fixierung

6 Zusammenfassung / Summary

6.1 Zusammenfassung

6.2 Summary

7 Literaturverzeichnis

8 Anhang

8.1 Tabellen

8.2 Lösungen, Puffer und Bezugsquellen

8.2.1 Lösungen und Puffer

VI Inhaltsverzeichnis

8.2.2 Bezugsquellen für Chemikalien, Seren, Antiseren und Geräte

9 Abkürzungsverzeichnis

–  –  –

1 Einleitung Die immunhistologische Darstellung einiger für die histopathologische Diagnostik und Forschung bedeutsamer Gewebsantigene (sogenannter fixierungs- und prozessierungssensitiver Antigene (Hicks et al., 2006)) ist in routinefixiertem und paraffineingebettetem Material nicht möglich, sodass zu diesem Zweck auf die Gefrierschnitttechnik zurückgegriffen werden muss (Blaschitz et al., 2008; Harley et al., 2011; Kiupel et al., 1999; Kunder et al., 2007; Waly et al., 2001). Diese gilt zwar nach wie vor als Goldstandard für den immunhistologischen Nachweis von Antigenen (Goldmann et al., 2012), ist allerdings mit einigen praktischen und logistischen Nachteilen behaftet und oftmals mit einem schlechteren Morphologieerhalt des Gewebes verbunden (Blaschitz et al., 2008; Braun et al., 2011; Breugelmans et al., 2011c;

Gonzalez et al., 2001; Hadler-Olsen et al., 2010a; Kähler et al., 2010; Kothmaier et al., 2011;

Leong et al., 2010; Löhler et al., 2009; Paavilainen et al., 2010; Preusser et al., 2010).

Erstrebenswert wäre daher die Etablierung eines Fixierungsverfahrens, das einen zuverlässigen immunhistologischen Nachweis auch formalin- und prozessierungssensitiver Epitope wie des Leukozytenoberflächenantigens CD8 gestattet und dabei gleichzeitig aufgrund guter morphologischer Detailerkennbarkeit eine zufriedenstellende histologische Beurteilung des Untersuchungsmaterials ermöglicht (Collings et al., 1984; Paavilainen et al., 2010; Wester et al., 2003). Zudem sollte es sich im Idealfall durch ein einfaches und flexibles Anwendungsprotokoll möglichst reibungslos in die zeitlichen Abläufe eines histodiagnostischen Routinelabors einfügen.

Ziel dieser Arbeit war, unter Verwendung des Zinksalzfixans (ZSF) nach Beckstead (1994) und der kommerziellen Hepes-Glutamic Acid Buffer-Mediated Organic Solvent Protection Effect (HOPE®)-Fixierung (Olert et al., 2001) die Eignung dieser beiden aldehydfreien Fixierungsmethoden für den zuverlässigen immunhistologischen Nachweis des fixierungs- und prozessierungssensitiven T-Lymphozytendifferenzierungsantigens CD8 in paraffineingebettetem, lymphatischem Gewebe der Katze zu untersuchen.

–  –  –

2 Literaturübersicht

2.1 Immunhistologie 2.1.1 Bedeutung und Einsatzgebiete Immunhistologische Verfahren sind auf dem Gebiet der Pathologie sowohl in der Forschung als auch in der Diagnostik von entscheidender Bedeutung für die Darstellung bestimmter Antigene (Dapson, 2007b; Goldstein et al., 2007; Leong und Wright, 1987; Werner et al., 2000).



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