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«zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprechts – Karl – Universität Heidelberg vorgelegt ...»

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INAUGURAL-DISSERTATION

zur

Erlangung der Doktorwürde

der

Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät

der

Ruprechts – Karl – Universität

Heidelberg

vorgelegt von

Diplom-Biologin Elke Schultz

aus: Pirmasens

Tag der mündlichen Prüfung: 01. Juni 2006

Identifizierung und Charakterisierung einer Protein-ProteinInteraktion beim Morbus Parkinson

Gutachter: Prof. Dr. Lutz Gissmann

Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Dieter Kübler An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Lutz Gissmann, Abteilung Genomveränderungen und Carcinogenese am DKFZ Heidelberg, für die Vertretung dieser Arbeit vor der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprechts – Karl – Universität Heidelberg zu vertreten.

Herrn Priv.-Doz. Dr. Dieter Kübler danke ich seine Bereitschaft sich als Zweitgutachter der Arbeit zur Verfügung zu stellen.

Bei Herrn Dr. Bernhard Korn möchte ich mich herzlich für die Möglichkeit, diese Arbeit am RZPD in Heidelberg durchzuführen, bedanken, ebenso für seine geduldige Unterstützung und ständige Diskussionsbereitschaft.

Besonders bedanken möchte ich mich Dr. Jeremy Simpson, Arbeitgruppe Prof. Dr. Pepperkok „Membrane traffic in the early secretory pathway“ am EMBL Heidelberg, für die tatkräftige Unterstützung und Hilfestellung bei der Durchführung der Co-Lokalisationsstudien und Immunpräzipitationen.

Danken möchte ich außerdem ganz herzlich Frau Dr. Claudia Langlais für ihre zahlreichen konstruktiven Diskussionen, ständige Hilfsbereitschaft und moralische Unterstützung.

Des weiteren möchte ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe des RZPD in Heidelberg für das angenehme Arbeitsklima und für die Hilfsbereitschaft bedanken, die ich im Verlauf der Arbeit sicher von jedem Mitarbeiter in irgendeiner Weise beansprucht und erhalten habe.

Mein spezielles Dankeschön geht an Mark –einfach dafür, dass er für mich da war und ist, und meine Stimmungsschwankungen klaglos ertrug.

Meinem Vater möchte ich von ganz besonderem Herzen danken, für seine liebevolle Unterstützung und sein Zutrauen, das mich immer wieder ermutigt und mir Kraft gegeben hat.

In Gedenken an Waltraud Schultz.

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion der proteasomalen Untereinheit alpha4 mit Parkin untersucht.

Frühere Untersuchungen in einem Yeast-Two-Hybrid-Screen mit einer humanen fötalen cDNA-Hirn-Bibliothek hatten Hinweise auf eine solche Wechselwirkung ergeben.

Um die Bindung zwischen Parkin und der alpha4-Untereinheit zu verifizieren, und um erste Hinweise auf die mögliche Bindungsdomäne in Parkin zu erhalten, wurde ein weiterer YeastTwo-Hybrid-Assay mit verschiedenen Parkin-Konstrukten, inklusive mutierten Proteinen von Parkin, durchgeführt. Dieser Assay bestätigte die Interaktion zwischen Parkin und alpha4, konnte jedoch keine Hinweise auf die Bindungsdomäne liefern, da sämtliche C-terminalen Konstrukte in einem Vortest (Reporteraktivitätsassay) als autoaktivierend reagierten und somit nicht bei der anschließenden Interaktions Mapping-Analyse eingesetzt werden konnten.

Als weitere Bindungsstudien wurden Co-Lokalisationsstudien, Co-Immunpräzipitationen.

Pull Down-Experimente und Gelfiltrationen durchgeführt.

Die Ergebnisse der übrigen Versuche ließen folgende Rückschlüsse bezüglich der Interaktion

zwischen der alpha4-Untereinheit des 26S Proteasoms und Parkin zu:

Zum einen konnte anhand der Ergebnisse ein Bindungsbereich eingegrenzt werden. Eine Bindung von alpha4 mit dem amino-terminalen Bereich von Parkin (Aminosäuren 1-191) kann ausgeschlossen werden. Dagegen wurde aber immer mit einem der carboxy-terminalen Fragmente von Parkin (Aminosäuren 192-465) eine Interaktion mit der alpha4-Untereinheit nachgewiesen. Dies lässt darauf schließen, dass die Bindungsdomäne in diesem carboxyterminalen Bereich von Parkin liegt.

Zum anderen zeigten die Ergebnisse, dass weder die Mutation in der Ring 1-Domäne (Mutante C289) noch in der Ring 2-Domäne (Mutante C418R) die Interaktion aufzuheben vermag.

Die Ergebnisse der verschiedenen Experimente für die einzelnen Parkin-Konstrukte waren teilweise unterschiedlich. Daher ist anzunehmen, dass sie Interaktion sehr schwach und/oder transient ist.

Die Interaktion von alpha4 mit Parkin ist ein bisher unbekanntes Phänomen, da bisher nur Interaktionen bekannt waren, bei denen Parkin mit Untereinheiten der 19S-Komplexe (Rpn10, Rpt6, Rpn1 oder Rpn2) des 26S Proteasoms interagiert. Die Untereinheit alpha4 gehört aber zu den Untereinheiten des 20S-Kernkompexes des 26S Proteasoms. Im Unterschied zu den Interaktionen mit Untereinheiten des 19S Komplexes, erfolgt hier die Bindung nicht am NTerminus von Parkin, sondern an seinem C-Terminus. Zudem ist alpha4 kein Substrat für die Parkin-abhängige Ubiquitylierung. Demzufolge könnten mögliche Funktionen dieser Interaktion Substrat-Präsentation an das 26S Proteasom sein, oder Regulierung der proteasomalen Aktivität.

Summary In this work the interaction between the proteasomal subunit alpha4 and Parkin was analysed.

Previous analysis in a Yeast-Two-Hybrid Screen with an human fetal cDNA brain library suggested such an interaction.





To verify the interaction between alpha4 and Parkin, and to get first hints on the potential binding region in Parkin, an additional Yeast-Two-Hybrid assay was performed using different Parkin constructs, including mutated proteins of Parkin. The assay indeed approved the interaction between Parkin and the proteasomal subunit alpha4, but did not revealed any hints on the binding domain since all C-terminal constructs of Parkin were shown to be autoactivating in a preceding reporter activity assay. Therefore those C-terminal constructs could not be set in the following interaction mapping analysis.

For other binding studies, co-localisations, co-immunoprecipitations, Pull Down assays and gel filtration were performed.

The results of the other experiments allowed the following conclusions in terms of the

interaction between the proteasomal subunit alpha4 and Parkin:

On the basis of these results the position of the binding domain was narrowed down: The binding of alpha4 with the amino-terminal domain of Parkin (amino acids 1-191) was ruled out. In contrast to this, using the carboxy-terminal constructs of Parkin (amino acids 192-465) an interaction with the alpha4 subunit was consistently shown. This led to the conclusion that the binding domain must be located in the carboxy-terminal part of Parkin.

Moreover the results showed that neither the mutation in the domain of ring 1 (mutant C289) nor the mutation in ring 2 domain (mutant C418R) was able to abolish the interaction.

The results of the experiments using the different Parkin constructs varied slightly. Thus it is assumed that the interaction is very weak and/or transient.

So far the interaction of alpha4 with Parkin is a unknown phenomenon, because until now the only interactions known for Parkin are with subunits of the 19S cap complex of the 26S proteasome (Rpn10, Rpt6, Rpn1 or Rpn2). However, the subunit alpha4 belongs to the 20S core complex of the 26S proteasome.

Unlike the interactions with the subunits of the 19S complex, where the binding takes place at the amino-terminus, in the case of the interaction with the alpha4 subunit the binding region is located at the carboxy-terminus of Parkin. Alpha4 is also not a substrate for Parkin-dependent ubiquitylation. Putative functions of the interaction might therefore be substrate presentation to the 26S proteasome or regulation of proteasomal activity.

Doktorarbeit Elke Schultz Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1.1.1 Abkürzungsverzeichnis

2 EINLEITUNG

2.1 DAS GEHIRN

2.2 MORBUS PARKINSON

2.2.1 Symptome des Morbus Parkinson

2.2.2 Therapie-Methoden

2.2.3 Parkinson-Genetik

2.2.4 Das Parkin-Gen PARK2

2.3 DAS 26S PROTEASOM

2.3.1 Modell des Parkin-vermittelten Ubiquitin-26S Proteasom-Proteinabbau-Weges

2.4 ZIELSETZUNG

3 MATERIAL

3.1 GERÄTE

3.2 CHEMIKALIEN

3.3 ENZYME

3.4 ANTIKÖRPER

3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE KITSYSTEME

3.6 HEFESTÄMME (SACCHAROMYCES CEREVISIAE)

3.7 BAKTERIENSTÄMME (ESCHERICHIA COLI)

3.8 ZELLEN

3.9 AMINOSÄURE-STAMMLÖSUNGEN

3.10 ANTIBIOTIKA-STAMMLÖSUNGEN

3.11 OLIGONUKLEOTIDE

3.12 SOFTWARE

3.13 SONSTIGE MATERIALIEN

4 METHODEN

4.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA

4.1.1 Minipräparation von Plasmid-DNA mittels „QIAprep Spin Miniprep Kit“ von QIAGEN

4.1.2 Midipräparation von Plasmid-DNA mittels „Plasmid Midi Kit“ von QIAGEN

4.1.3 Roboterpräparation von Plasmid-DNA im 96-well-Platten-Maßstab mittels „QIAwell 8 Ultra Plasmid Kit“ von QIAGEN

4.2 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN MITTELS „HIGH PURE PCR PRODUCT

PURIFICATION KIT“ VON ROCHE APPLIED SCIENCE

4.3 DNA-QUANTIFIZIERUNG MITTELS ABSORPTIONSSPEKTROMETRIE

4.4 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA

4.5 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS T4-LIGASE

4.6 MUNG BEAN-REAKTION

4.7 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION

4.8 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN

4.8.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterienzellen mittels KalziumchloridMethode

Doktorarbeit Elke Schultz Inhaltsverzeichnis 4.8.2 Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen nach Angaben von BioRad.. 46 4.8.3 Testen der Kompetenz kompetenter Zellen

4.9 TRANSFORMATION IN KOMPETENTE BAKTERIEN

4.9.1 Transformation in chemisch kompetente Bakterien

4.9.2 Transformation in elektro-kompetenter Bakterien

4.10 GATEWAYTM CLONING TECHNOLOGY

GATEWAYTM BP-Reaktion

4.10.1 GATEWAYTM LR-Reaktion

4.10.2

4.11 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE

4.12 DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN

4.12.1 Isolierung von DNA-Fragmenten aus TAE-gepufferten Agarosegelen mittels „QIAqick Gel Extraction Kit“ von QIAGEN

4.12.2 Isolierung von Plasmid-DNA-Fragmenten aus TAE-gepufferten Low Melting Point-Agarosegelen mittels „GELaseTM Agarose Gel-Digesting Preparation Kit“ von EPICENTRE

4.13 BACULOVIRUS EXPRESSION VECTOR SYSTEM

4.13.1 Co-Transfektion von adhärenten Insektenzellen Spodoptera frugiperda mit LIPOFECTIN® Reagent von Invitrogen

4.13.2 Virus-Amplifikation (1.VA und 2.VA) in Sf9-Zellen

4.13.3 Protein-Expression (PE) in Sf9-Zellen

4.14 ANALYTISCHE PRÄPARATION VON BACULO-EXPRIMIERTEN PROTEINEN AUS SF9ZELLEN ÜBER AFFINITÄTCHROMATOGRAPHIE

4.14.1 Reinigung von GST-getaggten Proteinen mittels Batch-Verfahren................. 70 4.14.2 Reinigung von GST-getaggten Proteinen mit selbst-gepackten Säulen........... 72 4.14.3 Bradford-Tüpfeltest

4.15 QUANTITATIVE PROTEIN-BESTIMMUNG MITTELS BRADFORD-TEST IM ELISA-READER

4.16 DENATURIERENDE SDS-GEL-ELEKTROPHORESE

4.17 PROTEIN-FIXIERUNG IM TRIS-HCL-SDS-POLYACRYLAMID-GEL

4.18 NACHWEISMETHODE FÜR PROTEINE IM POLYACRYLAMID-GEL: COOMASSIE-BLAUFÄRBUNG

4.19 WESTERN BLOT & IMMUNFÄRBUNG

4.19.1 Western Wet Blot

4.19.2 Färbung der transferierten Proteine zur Überprüfung der Blot-Effizienz via Ponceau S-Färbung

4.19.3 Blocken

4.19.4 Bindung der Erst- und Zweit-Antikörper & Visualisierung über Chemilumineszenz-Reaktion

4.20 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (POLYMERASE CHAIN REACTION)

4.21 ZELLKULTUR VON SPODOPTERA FRUGIPERDA (SF9)-ZELLEN

4.21.1 Auftauen von kryo-konservierten Sf9-Zellen

4.21.2 (Sub-)Kultivierung von Sf9

4.21.2.1 Sub-Kultivierung von Sf9-Monolayer-Kulturen

4.21.2.2 (Sub-)Kultivierung von Sf9-Suspensionskulturen

4.21.3 Vitalfärbung von Zellen mittels Trypanblau & anschließende Zellzahlbestimmung mittels Hämocytometer

4.22 ZELLKULTUR VON HELA-ZELLEN

4.23 TRANSFEKTION VON HELA-ZELLEN MIT DEM „FUGENE 6 TRANSFECTION REAGENT“

VON ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS

4.24 NACHWEIS VON MYCOPLASMEN MITTELS „VENORGEM PCR-KIT“ VON MINERVA

BIOLABS

Doktorarbeit Elke Schultz Inhaltsverzeichnis

4.25 IMMUNFLUORESZENZ

4.25.1 Zellfixierung mittels Methanol und anschließende Antikörpermarkierung... 101 4.25.2 Zellfixierung mittels Paraformaldehyd und anschliessende Antikörpermarkierung

4.26 NICHT-DENATURIERENDE CO-IMMUNPRÄZIPITATION

4.27 YEAST-TWO-HYBRID-ASSAY

4.27.1 Hefe-Co-Tansformation

4.27.2 Beta-Galactosidase-Test

4.28 GELFILTRATION

4.29 PULL DOWN

5 ERGEBNISSE

5.1 VERIFIZIERUNG DER GEFUNDENEN PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTION ÜBER EINEN

WEITEREN YEAST-2-HYBRID-ASSAY

5.1.1 Die verschiedenen Parkin- und alpha4-Klone für den Yeast-Two-Hybrid-Assay

5.1.2 C-terminale Parkin-Konstrukte sind Autoaktivierer

5.1.3 Parkin interagiert mit dem carboxy-terminalen Fragment der proteasomalen Untereinheit alpha4

5.2 KLONIERUNG DER PARKIN-KONSTRUKTE UND DES FRAGMENTES DER 26S

TM

PROTEASOMALEN UNTEREINHEIT ALPHA4 ÜBER DIE GATEWAY CLONING

TECHNOLOGY

5.2.1 Herstellung der Expressionsvektoren

Klonierung der Konstrukte in die GATEWAYTM-Expressionsvektoren.......... 130 5.2.2 5.2.2.1 Genspezifische PCR

5.2.2.2 attB-Tail-PCR

5.2.2.3 Überprüfung der Eingangsklone in dem Vektor pDONR201

5.2.2.4 Überprüfung der Expressionsklonen in den verschiedenen Vektoren....... 137

5.3 KLONIERUNG DER PARKIN-KONSTRUKTE UND DES FRAGMENTES DER 26S

PROTEASOMALEN UNTEREINHEIT ALPHA4 ÜBER DIE KLASSISCHE

RESTRIKTIONSKLONIERUNG

5.4 EXPRESSION DER BETEILIGTEN PROTEINE IM BACULOVIRUS EXPRESSION VECTOR

SYSTEM (BEVS)

5.5 NACHWEIS DER INTERAKTION VON PARKIN UND DEM CARBOXY-TERMINALEN

FRAGMENT DER PROTEASOMALEN UNTEREINHEIT ALPHA4 ÜBER PULL DOWNEXPERIMENTE



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