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«MANUELA FRANZ INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität ...»

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UNTERSUCHUNGEN ZU LEUKOZYTÄREN

OBERFLÄCHENANTIGENEN UND DER BILDUNG

VON IFN-g UND IL-4 BEI ZELLEN AUS DER

BRONCHOALVEOLÄREN LAVAGEFLÜSSIGKEIT

(BALF) VON PFERDEN MIT COB

MANUELA FRANZ

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet.

beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen édition scientifique

VVB LAUFERSWEILER VERLAG

Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt.

Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme.

1. Auflage 2006 All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior written permission of the Author or the Publishers.

1st Edition 2006 © 2006 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Printed in Germany

VVB LAUFERSWEILER VERLAG

édition scientifique STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 email: redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de Aus der Klinik für Pferde mit Lehrschmiede, Innere Medizin und dem Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuerin: PD Dr. Kerstin Fey Untersuchungen zu leukozytären Oberflächenantigenen und der Bildung von IFN- und IL-4 bei Zellen aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) von Pferden mit COB

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet.

beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von

MANUELA FRANZ

Tierärztin aus Reutlingen Gießen 2006 Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Dekan: Prof. Dr. Manfred Reinacher Gutachter/-in: PD Dr. Kerstin Fey Prof. Dr. Joachim Roth Tag der Disputation: 19.12.2006 Meinen Eltern Helga und Falk Franz gewidmet Felix qui potuit rerum cognoscere causas!

(Vergil, Georgica II, 490)

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Abkürzungsverzeichnis + positiv für ein bestimmtes Merkmal bzw. Antigen negativ für ein bestimmtes Merkmal bzw. Antigen ↑ Anstieg (einer Subpopulation) ↓ Abfall (einer Subpopulation) Abb. Abbildung A. dest. Aqua destillata AM Alveolarmakrophage BAL Bronchoalveolar Lavage (bronchoalveoläre Lavage) BALC Bronchoalveolar Lavage Cells (Zellen aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit) BALF Bronchoalveolar Lavage Fluid (bronchoalveoläre LavageFlüssigkeit) BALL Bronchoalveolar Lavage Lymphocytes (Lymphozyten aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit) BGA Blutgasanalyse (hier ausschließlich arteriell) BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius ca. cirka CD Cluster of Differentiation (Differenzierungscluster) COB Chronisch Obstructive Bronchi(oli)tis COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease (chronisch obstructive Lungenerkrankung) CpG unmethylierte Cytosinphosphat/Guanosindinukleotide aus bakterieller DNA DAA Deutsche Akademie für Akupunktur ECP Eosinophil Cationic Protein EDN Eosinophil Derived Neurotoxin EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Ethylendiamintetraessigsäure) EHV equines Herpesvirus Eos eosinophile Granulozyten EPO Eosinophile Peroxidase Eq/eq equines evtl. eventuell f. folgende (eine Seite) ff. folgende (mehrere Seiten) Fa. Firma FCS Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum) FITC Fluoreszein-Isothiozyanat g Gramm ggr. geringgradig GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor h hora (Stunde) H Heavy chain (schwere Kette des Immunglobulin-Moleküls) hgr. hochgradig H+L schwere (H=heavy) und leichte (L=light) Immunglobulin-Ketten IAD Inflammatory Airway Disease IE internationale Einheit IF Immunfluoreszenztest IFN Interferon IFN-γ Interferon-gamma Abkürzungsverzeichnis Ig Immunglobulin IgA Immunglobulin A IgD Immunglobulin D IgE Immunglobulin E IgG Immunglobulin G IgG(B) equiner Immunglobulinisotyp; Anstieg im Serum durch Immunisierung mit Bakterien-Antigen aus Pneumokokken IgG(T) equiner Immunglobulinisotyp; Anstieg im Serum durch Immunisierung mit Tetanus-Toxoid IgM Immunglobulin M IL Interleukin IL-4 Interleukin-4 IPT Immunphänotypisierung i. v. intravenös k. A. keine Angaben Kap. Kapitel Kilobasen (103 Basen) kb Kilodalton (103 Dalton) kDa kg Kilogramm KM Körpermasse L Light chain (leichte Kette des Immunglobulinmoleküls) LFA-3 Lymphocyte Function-Associated antigen-3 log Logarithmus LTB4 Leukotrien B4 LTC4 Leukotrien C4 Ly Lymphozyt µg Mikrogramm µl Mikroliter m Steigung der Regressionsgeraden M Makrophage mAk monoklonaler Antikörper Max. Maximum MBP Major Basic Protein mg Milligramm mgr. mittelgradig MHC Major Histocompatibility Complex min. Minuten Min. Minimum MIP-2 Macrophage Inflammatory Protein-2 ml Milliliter mmHg Millimeter Quecksilbersäule MMP Matrixmetalloproteinase mRNA messenger-RNA (Boten-RNA) MVA modifiziertes Vaccinia Virus Ankara MZ Mastzelle n Anzahl unabhängiger Versuche, auch Tierzahl NaAzid Natriumazid NF-B Nuclear Factor kappa B (Kernfaktor-B) NK Natürliche Killerzelle n. s. nicht signifikant ns Nanosekunde Abkürzungsverzeichnis

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Bei im Stall gehaltenen Pferden gilt die Chronisch Obstruktive Bronchitis (COB) in Europa als häufigste Lungenerkrankung erwachsener Tiere (DIXON et al. 1995a). Obwohl die klinischen Erscheinungen dieser Erkrankung wie Husten, Nasenausfluss, exspiratorische Dyspnoe und Leistungsschwäche bis hin zur Arbeitsunfähigkeit wohl bekannt sind (BEECH 1989a), beschränkt sich die Behandlung der Krankheit aufgrund mangelhafter Erkenntnis zur Pathogenese bis heute auf die Bekämpfung der Symptome.

Die equine COB weist in Bezug auf die Reversibilität der klinischen Symptomatik und das Ansprechen auf Glukokortikoide Gemeinsamkeiten mit dem atopischen Asthma des Menschen auf. Aus diesem Grund wurden von mehreren Autoren pathogenetische Parallelen vermutet. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass das beim Asthma dominierende Zytokinprofil der T-Helferzellen vom Typ 2 (TH2) auch für die charakteristische Entzündungsreaktion der tiefen Atemwege beim Pferd verantwortlich ist. Die Rolle von Lymphozytensubpopulationen bzw. der von unterschiedlichen T-Helferzellen produzierten TH1- bzw. TH2-Zytokinmuster in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) COBkranker Pferde war deshalb bereits Gegenstand mehrerer Untersuchungen (BERENDONK 2000; BEADLE et al. 2002; BOWLES et al. 2002; LAVOIE et al. 2001; GIGUÈRE et al.

2002; AINSWORTH et al. 2003; CORDEAU et al. 2004; HOROHOV et al. 2005; KLEIBER et al. 2005). Diese Arbeiten gelangten jedoch sowohl hinsichtlich der Bedeutung bestimmter Lymphozytensubpopulationen als auch hinsichtlich des vorherrschenden Zytokinprofils zu keinem einheitlichen Ergebnis. Bis auf eine Ausnahme (BERENDONK 2000) fanden die genannten Studien an Versuchspferden statt, bei denen durch Provokationsversuche mit Stäuben akute Krankheitsexazerbationen induziert wurden. Da beim größten Teil der COBPatienten in der heutigen Zeit allerdings eher chronische Formen von geringerem Schweregrad vorherrschen, die hinsichtlich vieler routinemäßig untersuchter Parameter Differenzen zu einer exazerbierten Erkrankung aufweisen, bleibt die Vergleichbarkeit dieser Versuchspferde mit klinischen Patienten auf immunologischer Ebene fraglich. Als kritisch im Hinblick auf die Typisierung der Lymphozyten muss außerdem gelten, dass keine der Arbeiten die Genauigkeit der Identifikationsmerkmale für die verschiedenen Arten von Zellen aus der BALF bei durchflusszytometrischen Analysen überprüft hat. Die Merkmale wurden regelmäßig aus der Untersuchung von Blutzellen übernommen, obwohl bekannt ist, dass Zellen aus der BALF in ihrer Größe deutlich von Blutzellen abweichen (CRYSTAL et al.

1986; MOORE und COX 1996). Der Nachweis von Zytokinen in der BALF des Pferdes 1 Einleitung wurde bislang ausschließlich über die Quantifizierung zytokinspezifischer mRNA geführt, obwohl posttranskriptionelle Modifikationen der Zytokinexpression Divergenzen zwischen dem Vorhandensein einer bestimmten mRNA und der tatsächlichen Anwesenheit des Proteins hervorrufen können (KLEIBER et al. 2005).

Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegende Hypothese war deshalb, dass eine verbesserte phänotypische und funktionelle Charakterisierung der Lymphozyten aus der BALF bei klinischen COB-Patienten lymphozytäre Veränderungen detektieren kann, die Rückschlüsse auf die Pathogenese der Erkrankung erlauben. Ziel der Untersuchungen war es zu überprüfen, ob diese Verbesserung durch eine simultane Markierung mehrerer Antigene und die Verwendung von Aktivierungsmarkern erreicht werden kann. Dazu erfolgten vor und nach Therapie eine detaillierte durchflusszytometrische Analyse von Granulozyten, Makrophagen und Lymphozytensubpopulationen und eine Überprüfung auf Divergenzen zur lichtmikroskopischen Differenzierung. Schließlich wurde der quantitative Nachweis der beiden Zytokine IFN- (TH1-Profil) und IL-4 (TH2-Profil) erstmals über eine direkte Markierung auf Einzelzellniveau geführt.

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2 Literaturübersicht

2.1 Das equine pulmonale Immunsystem 2.1.1 Makrophagen Makrophagen kommen im luftführenden Teil des equinen Respirationstrakt als so genannte Alveolarmakrophagen (AM) vor. Daneben existieren sie in der Lunge als interstitielle und intravaskuläre Zellen. Sie dienen beim Pferd in den Atemwegen, in Analogie zu anderen Tierarten und zum Menschen, der zellvermittelten, lokalen, unspezifischen Immunabwehr (SIBILLE und REYNOLDS 1990). Die Größe der AM steigt mit zunehmendem Alter von ca.

12 µm auf bis zu 40 µm (mehrkernige Riesenzelle) an. Sie besitzen eine runde bis ovale Form mit einem typischerweise zentral- oder randständigen, nierenförmigen Kern (CRYSTAL 1991; McGORUM und DIXON 1994). Ihre physiologische Aufgabe besteht in der Beseitigung von Mikroorganismen und anorganischen Partikeln. Neben Sauerstoffradikalen produzieren sie zu diesem Zweck, wie auch Granulozyten und bronchiale Drüsenzellen, Lysozym. Dieses proteolytische Enzym der biochemischen Abwehr lysiert Bakterien und fördert die Phagozytose (SIBILLE und REYNOLDS 1990; HERMANN 1984). Darüber hinaus besitzen Makrophagen durch die Sekretion unterschiedlicher Mediatoren die Fähigkeit zur Kommunikation mit anderen Abwehrzellen. So sind sie in der Lage, B-Lymphozyten und zytotoxische T-Zellen als Vertreter der spezifischen Abwehr anzulocken und das Immunsystem zu aktivieren, zu kontrollieren und gegebenenfalls auch zu hemmen. Diese Hemmung des Entzündungsgeschehens wird beispielsweise über den Transforming-GrowthFactor- (TGF-) und Prostaglandin E (PGE) bewerkstelligt und bezieht sich vor allem auf THelferzellen und B-Lymphozyten, aber auch auf neutrophile und basophile Granulozyten (CRYSTAL 1991). Neben der Beseitigung von Tumorzellen und der Reparatur von zerstörtem Lungengewebe präsentieren Makrophagen spezifischen Abwehrzellen Antigene (FELS und COHN 1986; CRYSTAL 1991).

Die Gruppe der AM vom Typ II spielt bei Säugern durch die Bildung von oberflächenaktiven Substanzen eine zusätzliche Rolle im pulmonalen Abwehrsystem. Die Aufgabe dieses so genannten Surfactants, einem Gemisch aus Phospholipiden und Proteinen, besteht zum einen in der Herabsetzung der Oberflächenspannung im Alveolarbereich. Andererseits heften sich Vertreter einer bestimmten Familie von Surfactant-Proteinen (Kollektine) bei Säugern an Atemwegspathogene und hüllen sie ein. Durch diese Opsonierung erfolgt eine Stimulation der Phagozytose von Pathogenen. Zusätzlich sind Kollektine in der Lage, die Zellen der adaptiven 2 Literaturübersicht Immunität, darunter beispielsweise dendritische Zellen und T-Lymphozyten, zu modulieren (BUFLER et al. 2004; WRIGHT 2004).

2.1.2 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) Mit einer physiologischen Obergrenze von weniger als 5% ist die relative (und die absolute) Anzahl der PMN (im folgenden auch kurz als „Neutrophile“ bezeichnet) in den Atemwegen lungengesunder Pferde gering (McGORUM et al. 1993). Neutrophile erreichen im ausgereiften Zustand eine Größe von 10-12 µm und besitzen polymorphe Kerne. Sie erfüllen ihre Aufgabe der unspezifischen Abwehr von Bakterien, Pilzen und einigen behüllten Viren mit der Hilfe von zahlreichen Enzymen wie Elastase, Kollagenase und Myeloperoxidase, die in den zelltypischen neutrophilen Granula gespeichert werden. Die Myeloperoxidase ist ein entscheidender Faktor bei der Bildung verschiedener Sauerstoffradikaler zur Bekämpfung von Mikroorganismen (so genannter Oxidative-Burst) (LEHRER et al. 1988; ABRAMSON et al.

1991). Über Zytokine und Mediatoren, die teilweise von Makrophagen aber auch von TLymphozyten sezerniert werden [z. B. Leukotrien B4 (LTB4), Interleukin- (IL)-8 und TumorNekrose-Faktor- (TNF-)], erfolgt ihre Anlockung und Aktivierung. Bevor Partikel von PMN phagozytiert werden können, muss eine Opsonierung durch den Überzug mit Antikörpern oder Komplement stattfinden (LEHRER et al. 1988).

Neben diesen physiologischen Funktionen können Neutrophile bei krankhaften Zuständen der Lunge größere Gewebeschäden anrichten. Für die Entstehung des Lungenemphysems des Menschen spielt insbesondere die Elastase eine wichtige Rolle (ABRAMSON et al. 1991), und bei der Chronisch Obstruktiven Bronchitis (COB) des Pferdes wird zumindest ein Teil der entzündlichen Atemwegsveränderungen der vermehrten Anwesenheit von Neutrophilen zugeschrieben. Daneben ist sowohl bei der Inflammatory Airway Disease (IAD), die für mangelhafte Leistungsfähigkeit bei jungen Rennpferden verantwortlich gemacht wird, als auch bei bakteriellen Pneumonien eine Neutrophilie im Lungensekret und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) zu beobachten. Bei Infektionen durch Bakterien sind typischerweise degenerierte Neutrophile und Makrophagen mit phagozytierten Erregern nachzuweisen (LARSON und BUSCH 1985; DERKSEN et al. 1985; DIECKMANN und DEEGEN 1990a; WINDER et al. 1991; McGORUM und DIXON 1994; MOORE und COX 1996; FRANCHINI et al. 1998).



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