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«Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Hohen Medizinischen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn ...»

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Untersuchungen zum Auftreten apoptotischer Zellen in menschlichen Venen in

Abhängigkeit von dem Lagerungsmedium

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades

der Hohen Medizinischen Fakultät

der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität

Bonn

Christina Gebhart

aus Bonn

Angefertigt mit Genehmigung der

Medizinischen Fakultät der Universität Bonn

1.Gutachter: Prof. Dr. med. C. J. Preuße

2.Gutachter: PD Dr. med. L. Pizzulli

Tag der Mündlichen Prüfung: 14.10.2011 Klinik und Poliklinik für Herzchirurgie der Universität Bonn Direktor: Prof. Dr. med. A. Welz Meinen Eltern in Dankbarkeit und Liebe gewidmet Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis…………………………………………………………….. 7

1. Einleitung

1.1 Bedeutung und Entwicklung der Koronarchirurgie

1.2 Morphologische Unterschiede zwischen Venen und Arterien

1.2.1 Die Vena saphena magna

1.3 Ursachen der Endothelzellschäden in venösen Grafts

1.4 Mögliche Vermeidungsstrategien der Endothelzellschäden in venösen Grafts

1.5 Okklusionsraten venöser und arterieller Grafts

1.5.1 Die Thrombose

1.5.2 Die Intimahyperplasie

1.5.3 Die Arteriosklerose

1.6 Die Apoptose

1.7 Die Lösungen Via Span und Z44

1.7.1 Die Lösung Via Span

1.7.2 Die Lösung Z44

1.8 Ziel der Arbeit

2. Material und Methoden

2.1 Materialgewinnung

2.1.1 Patientenkollektiv

2.1.2 Versuchsaufbau

2.1.3 Versuchsdurchführung

2.2 Histochemie und Immunhistochemie……………………………………….. 24 2.2.1 TUNEL-Test

2.2.2 Durchführung des TUNEL-Testes…………………………………………... 25 2.2.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung

2.3 Bestimmung der Morphologie

2.3.1 Quantitative Bestimmung der Zelldichte

2.3.2 Quantitative Bestimmung der Expression immunhistochemischer Signale.... 28

2.4 Statistische Analyse…………………………………………………………...29

2.5 Geräte und sonstige Materialien…………………………………………….. 30 2.5.1 Chemikalien und Zusatzlösungen für den TUNEL-Test……………………. 30 2.5.2 Chemikalien und Zusatzlösungen für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung……. 30 2.5.3 Geräte und weitere Materialien……………………………………………… 31

3. Ergebnisse……………………………………………………………………34

3.1 Histologische Auswertung

3.2 Statistik

3.3 Apoptoseraten in beiden Lösungen

3.4 Apoptoseraten in den einzelnen Wandschichten…………………………….. 38 3.4.1 Endothel

3.4.2 Subendothel

3.4.3 Media

3.4.4 Adventitia

3.4.5 Gegenüberstellung von Apoptoserate und Kaliumkonzentratation der Lösungen………………………………………………………………… 47 4. Diskussion

5. Zusammenfassung…………………………………………………………. 56 6. Literaturverzeichnis……………………………………………………….. 58 7. Danksagung……………………………………………………………….... 66 8. Lebenslauf……………………………………………………………………67 Abkürzungsverzeichnis

–  –  –

1. Einleitung

1.1 Bedeutung und Entwicklung der Koronarchirurgie Die aortokoronare Bypassoperation ist in Deutschland die am häufigsten durchgeführte Operation in der Herzchirurgie. Jährlich werden etwa 75000 Patienten mit koronarer Herzerkrankung operativ versorgt (Stand 2000). Die aortokoronare Bypassoperation macht damit ca. 75% aller Herzoperationen aus. Als Bypassmaterial stehen neben den arteriellen Grafts autologe Venen, hauptsächlich die Vena saphena magna, zur Verfügung. Diese wird in ca. 95% aller aortokoronaren Bypassoperationen genutzt (Düsterhöft, 2000). Neben der Vena saphena magna werden die Vena saphena parva und im „Notfall“ auch die Vena cephalica verwendet. Als arterielle Grafts werden die Arteria mammaria interna, die Arteria radialis, die Arteria gastroepiploica und die Arteria epigastrica verwendet (Emmrich, 1998).

Die koronare Herzkrankheit ist neben der zerebrovaskulären Insuffizienz und der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit eine der häufigsten und bedrohlichsten Manifestationsformen der Arteriosklerose (Emmrich, 1998). Als Risikofaktoren, die die Bildung von arteriosklerotischen Plaques begünstigen, gelten die arterielle Hypertonie, die genetische Prädisposition, der Diabetes mellitus, der Nikotinabusus, die Hypercholesterinämie und das männliche Geschlecht.

Am 23. Mai 1964 wurde die erste aortokoronare Bypassoperation mit der Vena saphena magna durch H.E. Garrett am schlagenden Herzen ohne Einsatz der Herz-Lungen-Maschine vorgenommen, jedoch erst 1973 veröffentlicht (Garrett et al., 1973). Die aortokoronare Bypassoperation mit Einsatz der Herz-Lungen-Maschine, auf der die heute üblichen Operationstechniken basieren, wurde in den Jahren 1967 und 1968 etabliert, wobei die größte Pionierleistung R.G. Favaloro zugesprochen wird (Favaloro, 1969). Die Entwicklung der Herz-Lungen-Maschine durch John H.





Gibbon im Jahre 1953 bedeutete einen Meilenstein für die Koronarchirurgie und machte Operationen am nicht schlagenden Herzen erstmals möglich (Gibbon, 1954).

Der erste arterielle Bypass wurde bereits 1964 mit der IMA durchgeführt (Kolessov, 1967).

Ein wesentliches Problem in der Koronarchirurgie stellt die hohe Okklusionsrate der venösen Grafts im Vergleich zu arteriellen Grafts dar.

Die Offenheitsrate in venösen Grafts liegt nach einem Jahr bei 84% und sinkt nach zehn Jahren auf 61% ab. Im Gegensatz dazu liegt die Offenheitsrate der IMA nach zehn Jahren noch bei 85% (Goldman et al., 2004).

1.2 Morphologische Unterschiede zwischen Venen und Arterien Arterien bestehen aus drei Wandschichten, Intima, Media und Adventitia. Die Intima grenzt das Lumen nach innen ab und besteht aus einem einschichtigen Endothel, welches sich aus platten, polygonalen Zellen zusammensetzt. Die Endothelzellen sind durch ’tight junctions’ miteinander verbunden. Die Media ist die breiteste Schicht der Arterienwand und besteht aus glatten Muskelzellen, die innen longitudinal und außen zirkulär angeordnet sind. Die Adventitia enthält elastische Fasern, Kollagen, Fibroblasten und Proteoglykane.

In den Venen lässt sich neben dem Endothel das Subendothel erkennen. Dieses besteht aus Kollagen, vereinzelten glatten Muskelzellen, Fibroblasten und Elastin. Die Endothelzellen sind größer und flacher als in der Arterie und die ’tight junctions’ zwischen den Endothelzellen weisen eine höhere Permeabilität auf als die der arteriellen Endothelzellen. Die Media besteht aus longitudinalen und zirkulären Muskelzellen, die mit elastischen und kollagenen Fasern durchsetzt sind.

Die Adventitia besteht zum großen Teil aus kollagenen Bündeln, die von elastischen Fasern umgeben sind. Sie ist häufig dicker als die Media und besitzt mehr Vasa vasorum als die Arterien, weshalb die intakte Venenwand eine geringere Vulnerabilität gegenüber ischämischen Schäden aufweist (Cheanvechai et al., 1975).

Von großer Bedeutung sind die Endothelzellen der Gefäße, da sie den vasomotorischen Tonus kontrollieren, die Blutgerinnung beeinflussen, in das Entzündungsgeschehen und die Fibrinolyse eingreifen sowie die Proliferation und Regeneration von vaskulären Gefäßen regulieren. Durch ihre günstige Lage zwischen Blut und Interstitium können sie sowohl intravaskuläre als auch extravaskuläre Vorgänge beeinflussen.

Das Endothel reagiert sehr sensitiv auf Hypoxie, Zytokinexposition, Endotoxin, Nikotin oder iatrogene Schäden in Form von chirurgischer Manipulation. Durch diese Schäden werden die Endothelzellen aktiviert und nehmen am Entzündungsgeschehen teil. Es kommt zur Vasokonstriktion, Koagulation, Leukozytenadhäsion und Proliferation der glatten Muskelzellen (Pober und Cotran, 1990). Diese Reaktionen stellen Schutzmechanismen der Zelle dar.

Wenn diese Stimuli kontinuierlich bestehen, kommt es zu einer übersteigerten Reaktion, die zu Gewebeschaden und geminderter Organfunktion führt (Ross, 1995).

Die Endothelzellen beeinflussen die Blutgerinnung unter anderem durch die Bildung des Thrombomodulins, das an der Oberfläche der Endothelzellen gebildet wird (Verrier und Boyle, 1996).

Weiterhin synthetisieren sie sowohl vasokonstriktorische als auch vasodilatative Mediatoren. Zu den Vasokonstriktoren zählen unter anderem Angiotensin II, Serotonin und Endothelin-1 (Bryan und Angelini, 1994). Wichtige Vasodilatatoren sind NO, Adenosin und Prostazyklin (Yang und He, 2005). NO hemmt zugleich die Plättchenaggregation (Radomski et al., 1990; Tsui et al., 2001). Des Weiteren hemmt es die Proliferation glatter Muskelzellen (De Caterina et al., 1995) und induziert die Apoptose in vaskulären Zellen (Nishio et al., 1996). Eine weitere wichtige Funktion des NO ist die Inaktivierung der freien Sauerstoffradikale (Davies et al., 1994). Ebenfalls zu den Vasodilatatoren zählt EDHF (Yang und He, 2005).

Wenn Endothelzellen verletzt werden, z.B. im Rahmen der Bypassoperation, produzieren sie Vasokonstriktoren wie Endothelin, Thromboxan A2 und Angiotensin II (Luscher, 1991).

Das Endothel bildet außerdem Wachstumsfaktoren und auch Wachstumsinhibitoren, die die Gefäßwandstruktur bestimmen. Zu den Wachstumsfaktoren gehören das PDGF, das bFGF, das IGF1 und das IL-1. Wichtige Wachstumsinhibitoren, die das Endothel produziert, sind Heparin und Heparin- Sulfat (Luscher et al., 1993).

Tabelle 1 zeigt den Unterschied der Physiologie zwischen Vene und Arterie.

–  –  –

Tabelle1: Physiologie der Vene und Arterie (Cox et al., 1991) 1.2.1 Die Vena saphena magna Es gibt spezifische Merkmale der Vena saphena magna. Sie besitzt mehr Muskulatur und Elastin als andere Venen. Ca. 1% der nativen Vena saphena magna zeigt bereits vor der Verwendung als venöses Graft eine Stenose von 50% (Hassantash et al., 2008). Bis zu 95% der Menschen im Alter von 60 bis 70 Jahren zeigen eine Intimaverdickung der Vena saphena magna auf Grund vorbestehender Phlebosklerose (Stanley et al., 1973).

1.3 Ursachen der Endothelzellschäden in venösen Grafts

Die Schädigung der Endothelzellen in venösen Grafts begünstigt sowohl die Entstehung der Intimahyperplasie mit der Folge einer langfristigen Stenose als auch den frühzeitig thrombotischen Graftverschluss. Die vor der Reperfusion vorherrschende Hypoxie/ Ischämie führt zu Endothelschäden, die reversibel sind, solange die Hypoxie/ Ischämie nur von kurzer Dauer ist.

Besteht dieser Zustand länger als 24 Stunden, zeigen bis zu einem Viertel der Endothelzellen apopto-tische Veränderungen (Li et al., 1999). Diese Rate steigt nach 48 Stunden auf 55% an (Stempien-Otero et al., 1999). Die Hypoxie entsteht, da die Vene als freies Transplantat genommen wird. Zu den durch Hypoxie/ Ischämie verursachten Endothelschäden gehören die Reduktion der Proteinsynthese und des ATP, die zur Abnahme der intrazellulären Energie führen (Tretyakov und Farber, 1995). Des Weiteren steigen die anaerobischen Metabolite an, die sowohl intra- als auch extrazellulär zu einer Azidose führen (Ogawa et al., 1990).

Signifikante Endothelzellschäden werden ebenfalls durch die Präparation der Vene, die Druckerhöhung während der Dichtigkeitsüberprüfung (Cook et al., 2004) und längere Ischämiezeiten durch Zwischenlagerung auf dem OP-Tisch herbeigeführt (Davies und Hagen, 1995). Zudem kommt es nach der Anastomosierung des venösen Grafts zu einer Überstreckung und zu tangentialem Stress (Shuhaiber et al., 2002).

Während der Reperfusion des venösen Grafts mit oxygeniertem Blut häufen sich vermehrt neutrophile Granulozyten an hypoxie-ischämie geschädigten Endothelzellen an (Verrier und Boyle, 1996). Diese aktivierten neutrophilen Granulozyten setzen freie Sauerstoffradikale und proteolytische Enzyme frei, wodurch sowohl gesunde Zellen, als auch die Extrazellulärmatrix zerstört werden. Die Barrierefunktion des Endothels wird geschädigt und es kommt zu Zellödem und weiteren funktionellen Schäden des Endothels (Weiss, 1989).

Zudem steigt das plasmatische Fibrinogen durch den operativen Eingriff an und fördert eine prothrombotische Reaktion (Moor et al., 1994).

1.4 Mögliche Vermeidungsstrategien der Endothelzellschäden in venösen Grafts

Intraoperative Vermeidungsstrategien zur Reduktion der Endothelzellschäden beinhalten die so genannte „no-touch“ Technik, welche einen minimalen instrumentalen und manuellen Kontakt empfiehlt (Gottlob, 1977). Die Dehnung der Vene sollte vermieden werden, indem die Dichtigkeitsüberprüfung mit einem Druck unter 100mmHg durchgeführt wird (Adcock et al., 1984). Die verwendete Lösung, in der die Vene zwischenlagert, ist ebenfalls von großer Wichtigkeit und geht mit funktionellen und morphologischen Änderungen des Endothels einher (Shuhaiber et al., 2002). Wie bereits erwähnt, weist die Vena saphena magna in bis zu 95% der Fälle von Patienten zwischen 60 und 70 Jahren eine Intimaverdickung auf, die zur Stenose prädisponiert (Stanley et al., 1973).

Zu den postoperativen Vermeidungsstrategien, die der Reduktion der Endothelzellschäden dienen, zählt unter anderem die tägliche Gabe von Aspirin. Damit sollte sechs Stunden nach der Bypassoperation begonnen werden, sofern das mit dem Risiko für postoperative Nachblutungen vereinbar ist (Motwani und Topol, 1998).

Ein arterielles Graft sollte nach Möglichkeit bevorzugt werden, da es weitaus bessere Langzeitergebnisse aufweist (Motwani und Topol, 1998).

1.5 Okklusionsraten venöser und arterieller Grafts



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