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«Funktionelle Untersuchung der flussbedingten mechanosensorischen Eigenschaften der Primärzilie INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des ...»

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Aus der Medizinischen Universitätsklinik

Abteilung Innere Medizin IV

(Nephrologie)

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.

Funktionelle Untersuchung der flussbedingten

mechanosensorischen Eigenschaften der Primärzilie

INAUGURAL-DISSERTATION

zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

Vorgelegt 2007

von Fruzsina Kotsis

geboren in Szeged/ Ungarn Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters Erstgutachter: Prof. Dr. med. Gerd Walz Zweitgutachter: Prof. Dr. med. Heymut Omran Jahr der Promotion: 2008 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung

1.1 Die polyzystische Nierenererankung (Polycystic Kidney Disease, PKD)............ 4 1.2 Die autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD).............. 4 1.2.1 Epidemiologie, Symptome, Therapie

1.2.2 Bekannte genetische und molekulare Hintergründe

1.3 Die autosomal-rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD)................. 6 1.3.1 Epidemiologie, Symptome, Therapie

1.3.2 Bekannte genetische und molekulare Hintergründe

1.4 Die Zilien-Hypothese der Zystformation

1.4.1 Struktur der Primärzilie

1.4.2 Die Zilien-Hypothese

1.4.3 Funktion der primären Zilie

1.5 Kalziumsignaltransduktion

1.6 Struktur und Funktion der Zentrosomen

1.6.1 Struktur der Zentrosomen

1.6.2 Funktion der Zentrosomen

1.7 Zielsetzung der Doktorarbeit

2 Material und Methoden

2.1 Zellarbeiten

2.1.1 Zellkultur und Subkultivierung

2.1.2 Transfektion

2.2 Flussexperimente in der Perfusionskammer

2.2.1 Die Perfusionskammer

2.2.2 Die Pumpen

2.2.3 Temperatur

FURA-2 Ca2+-Messungen

2.3 2.3.1 Aufbau und Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe

2.3.2 Messprinzip

2.3.3 Anwendung

2.3.4 Messaufbau

2.3.5 Messprotokoll

2.4 Verwendete Lösungen, Substanzen

2.5 Fluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen

2.6 Daten- und Bildverarbeitung

2.6.1 Software und Dateiformate

2.6.2 Dekonvolution, Z-Projektion

2.6.3 Bewegungsanalysen

2.7 Statistik

3 Ergebnisse

3.1 Die Auswirkung vom Beugen der Zilie auf die intrazelluläre Ca2+-Konzentration und PKC-Verteilung in MDCK-Zellen

Der flussinduzierte [Ca2+]i-Anstieg ist zilienabhängig

3.1.1 Negativkontrollen des zilienvermittelten [Ca2+]i-Anstieges

3.1.2 3.2 Flussbedingte Translokation der PKC zur Plasmamembran

TRPV4 und Kim1 sind am flussbedingten [Ca2+]i-Anstieg beteiligt................. 42 3.3 Hemmung der flussbedingten [Ca2+]i-Anstiege durch Ruthenium Rot

3.3.1 Kim1 lokalisiert in der Zilie und ist am flussbedingten [Ca2+]i-Anstieg beteiligt........... 43 3.3.2 3.4 Beugen der Zilie durch Fluss beeinflusst die Mobilität der Zentriole............... 49 3.4.1 Charakterisierung der Zentriolendynamik

3.4.2 Die Zentriole bewegen sich unter Flussbedingungen präferentiell in der Flussachse und zeigen eine längere zurückgelegte Gesamtstrecke

3.4.3 Fluss verändert die durchschnittliche Winkeländerung der Zentriolenachse.................. 54

4 Diskussion

4.1 Eine fluoreszenz-mikroskopische Methode für flussbedingte intrazelluläre Änderungen

4.1.1 Etablierung einer neuartigen Perfusionskammer

Die flussbedingte Änderung der freien zytosolischen Ca2+-Konzentration ist 4.1.2 zilienabhängig

Verlauf der zilienabhängigen Ca2+-Signale

4.1.3 4.1.4 Die flussbedingte Translokation von Protein Kinase C zur Plasmamembran ist zilienabhängig

4.2 Kim1 und TRPV4 sind zwei neue Komponenten der zilienvermittelten Ca2+-Signalkaskade

Hemmung von TRPV4 hebt die zilienabhängigen [Ca2+]i-Anstiege auf.

4.2.1 Kim1 moduliert die zilienvermittelte Ca2+-Signalkaskade

4.2.2 4.3 Unter Flussbedingungen ändert sich die Zentriolenmobilität in Zilientragenden MDCK-Zellen

5 Zusammenfassung

6 Ausblick

7 English Summary

8 Anhang

8.1 Abkürzungsverzeichnis

8.2 Abbildungsverzeichnis

8.3 Literaturverzeichnis

8.4 Publikationen

8.5 Lebenslauf

9 Danksagung

1 Einleitung

1.1 Die polyzystische Nierenererankung (Polycystic Kidney Disease, PKD) Die polyzystische Nierenerkrankung ist eine der häufigsten hereditären Nierenerkrankungen und ist eine der Hauptursachen für das terminale Nierenversagen (Gabow, P.A. 1993b; Zerres, K. et al. 1984) Aufgrund der Symptome, der Altersunterschiede und der genetischen Hintergründe unterscheidet man die autosomaldominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) und die autosomal-rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD). Die ADPKD tritt mit einer Wahrscheinlichkeit von 1:500 bis 1:1000 im Erwachsenenalter auf, hauptsächlich verursacht durch Mutationen in einem von zwei Genen: PKD1 oder PKD2 (Boucher, C. et al. 2004). Im Vergleich dazu betrifft die ARPKD Kinder mit einer Häufigkeit von 1:20000 bei Lebendgeburten und entsteht durch Mutationen in einem einzelnen Gen: PKHD1 (polycystic kidney and hepatic disease Gene 1) (Harris, P.C. 2002). Die vorwiegenden pathologischen Manifestationen sind 1.) Umschriebene Zystenformation entlang des Nephrons bei ADPKD und vorwiegend in den Sammelrohren bei ARPKD weiterhin 2.) Veränderungen der Zellpolarität; 3.) vermehrte Zellteilung 4.) Veränderung in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix. (Wilson, P.D. 2004a)





1.2 Die autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD)

1.2.1 Epidemiologie, Symptome, Therapie Die autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) wird auch als polyzystische Nierenerkrankung des Erwachsenen oder zystische Nierendegeneration Potter Typ III bezeichnet. Sie ist weltweit verbreitet und eine der häufigsten bekannten monogenen Erbkrankheiten. Sowohl Frauen als auch Männer sind mit einer Häufigkeit von 1:500 bis 1:1000 betroffen (Calvet, J.P. et al. 2001; Grantham, J.J.

1992). Ungefähr in der Hälfte der betroffenen Patienten entwickelt sich eine terminale Niereninsuffizienz in der 5-6. Lebensdekade. Die Zysten, die sich manchmal vom Ausgangsnephron trennen, entstehen fokal in allen Segmenten des Nephrons und vergrößern sich durch Proliferation und Ansammlung von Zystflüssigkeit (Grantham, J.J. et al. 1987). Im Gegensatz dazu entstehen in der rezessiven Form der Krankheit, die fusiform angeordneten Zysten durch Erweiterung der Sammelrohre und behalten ihre Verbindung mit dem Ausgangsnephron.

Im Laufe des Lebens entstehen bei den Betroffenen in beiden Nieren, in der Nierenrinde und im Nierenmark unzählige Zysten verschiedener Größe, die mit fortschreitendem Alter massiv an Volumen zunehmen und die Nieren in ihrer Funktion stark beeinträchtigen (Grantham, J.J. et al. 2006). Zusätzlich zu den Nierenveränderungen finden sich häufig auch Zysten in der Leber und im Pankreas, sowie Kolondivertikel, Nierensteine, gestörte Harnkonzentrierung, Aortenaneurysmen, Herzklappenvitien und bei 4 bis zu 10% der Patienten zerebrale Aneurysmen (Gabow, P.A. 1993a).

Erste Symptome treten ab der dritten bis vierten Lebensdekade in Form von Bluthochdruck, schlechtem Allgemeinzustand, Hämaturie, rezidivierenden Harnwegsinfekten, Flankenschmerzen oder Anzeichen einer Niereninsuffizienz auf (Igarashi, P.

et al. 2002).

Diagnostisch sind insbesondere Bildgebende Verfahren wie Ultraschall oder Computertomographie relevant, sowie in 60% der Fälle eine positive Familienanamnese (Rizk, D. et al. 2003). Differentialdiagnostisch müssen andere genetisch bedingte Zystenerkrankungen der Niere ausgeschlossen werden, wie z.B. die Nephronophthisen (NPHP), die autosomal-dominante medulläre Zystennieren-Erkrankung (ADMCKD) oder die von-Hippel-Lindau-Erkrankung. Darüber hinaus müssen eine Echinokokkose oder zystische wachsende Tumore abgegrenzt werden (Arnaout, M.A. 2001). Sporadische Nierenzysten kommen in der Bevölkerung sehr häufig vor, haben aber selten Krankheitswert.

Es gibt bislang keine kausale Therapie. Die Einstellung des Bluthochdrucks, die rechtzeitige Diagnose von Komplikationen wie Zystenblutungen und -infektionen, sowie die Prophylaxe (Screening) von zerebralen Aneurysmen sind von großer Wichtigkeit. Bei terminaler Niereninsuffizienz stehen die Dialyse und die Nierentransplantation als Therapien der Wahl zur Verfügung. Interessanterweise haben tierexperimentelle Studien eine Regression der Erkrankung mit Vasopressininhibitoren und dem mTOR (mamalien target of rapamycin) Inhibitor Rapamycin gezeigt. Vor kurzem sind erste Interventionsstudien mit diesen Wirkstoffen bei humanen Patienten angelaufen. Insgesamt geht die Erkrankung mit einer reduzierten Lebenserwartung einher, die durch die Folgen der terminalen Niereninsuffizienz, dem teilweise schwer beherrschbaren Hypertonus oder durch die Ruptur eines Hirnbasisarterienaneurysmas bedingt ist.

1.2.2 Bekannte genetische und molekulare Hintergründe Bei ca. 85% der Betroffenen wird die ADPKD durch Mutationen im PKD1-Gen verursacht (The European Polycystic Kidney Disease Consortium 1994). Mutationen im PKD2-Gen, das für das Protein Polycystin 2 kodiert, sind für etwa 15% der Erkrankungen verantwortlich (Arnaout, M.A. 2001; Boucher, C. et al. 2004) Mutationen von PKD1 oder PKD2 verursachen praktisch ein identisches Krankheitsbild, weshalb vermutet wird, dass die entsprechenden Proteine gemeinsame Funktionen übernehmen. Defekte im Gen für Polycystin 2 scheinen aber zu einem etwas milderen Phänotyp und einem leicht verzögerten Auftreten der Niereninsuffizienz im Vergleich zu Mutationen im PKD1-Gen zu führen. Die Mutationen führen zu Veränderungen des Epithels und der Basalmembran der Nierentubuli. Diese Vorgänge resultieren schließlich darin, dass durch Umkehr der Zellpolarität aus dem resorbierenden Epithel ein sezernierendes wird.

Mutationen sind in PKD1 und PKD2 identifiziert worden. Das Genprodukt Polycystin 1 (PC1) ist ein großes integrales Membranprotein mit rezeptorähnlichem Aufbau. Es ist an der Plasmamembran lokalisiert und fungiert möglicherweise als Mechanosensor (Arnaout, M.A. 2001; Delmas, P. 2004). Polycystin 2 (PC2) ist ein Mitglied der erweiterten transienten Rezeptorpotential-Kanäle (TRP) und bekannt als Ca2+-selektiver Kationen-Kanal, welcher funktionsabhängig an der Plasmamembran oder am Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist (Kottgen, M. et al. 2005b;

Kottgen, M. et al. 2005a). Neueste Untersuchungen zeigen, dass Polycystin 1 und Polycystin 2 gemeinsam an der Initiation einer Kalzium-vermittelten Signaltransduktionskaskade beteiligt sind, deren Deregulation bzw. Ausfall zur Zystenentstehung führt. Dies könnte den identischen Phänotyp bei Mutationen der PKD1und PKD2-Gene erklären (Cantiello, H.F. 2004; Delmas, P. et al. 2004b).

1.3 Die autosomal-rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD) 1.3.1 Epidemiologie, Symptome, Therapie Die autosomal-rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD) wird auch als polyzystische Nierenerkrankung der Kinder (Neugeborene, Säuglinge) oder zystische Nierendegeneration Potter Typ I bezeichnet. Die Krankheit wird in den meisten Fällen schon im Neugeborenenalter aufgrund von ausgeprägten, vergrößerten, echogeYou are reading a preview. Would you like to access the full-text?

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