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«DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTÄT III – BIOLOGIE UND ...»

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Genetic Analysis of the Sall Transcription

Factor Family in Murine Development

DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER

NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN

FAKULTÄT III – BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN DER UNIVERSITÄT

REGENSBURG

vorgelegt von

Ulrich Elling aus Freising Promotionsgesuch eingereicht am: 21. November 2005 Die Arbeit wurde angeleitet von: Dr. M. Treier Doktorvater: Prof. Dr. Schneuwly Thesis advisory committee, EMBL: Dr. S. Cohen Dr. C. Nerlov

Prüfungsausschuß:

Vorsitzender: Prof. Dr. Kunzelmann

1. Gutachter Prof. Dr. Schneuwly

2. Gutachter Prof. Dr. Witzgall

3. Prüfer: Prof. Dr. Seufert Ersatzperson: Prof. Dr. Warth Zusammenfassung Zusammenfassung Spalt Proteine bilden eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die von Caenorhabdits elegans über Drosophila melanogaster bis hin zu Vertebraten konserviert sind. In Säugetiergenomen findet man jeweils vier Gene, die als Spalt-like (SALL1 bis SALL4) bezeichnet werden. Mutationen in SALL1 und SALL4 verursachen im Menschen TownesBrocks-Syndrom (TBS) beziehungsweise Okihiro-/Duane Radial Ray-Syndrom (DRRS).

Beide Syndrome variieren stark in ihrem klinischen Befund, beschrieben sind unter anderem Verdopplung oder Fehlen von Fingern und Zehen, Schäden im zentralen Nervensystem sowie Missbildungen im Urogenitalsystem. Wie es zu diesen multiplen Fehlbildungen kommt ist nicht verstanden. Aufbauend auf eine systematische, vergleichende Untersuchung der Expressionsmuster wurden in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen von Mutationen in Sall1 bis Sall4 auf die Embryonalentwicklung von Mäusen einzeln oder in Kombination untersucht. Bisher wurde nur gezeigt, dass Verlust von Sall1 zur Nierenagenese führt. Das Ziel war deshalb, durch Untersuchung der verschiedenen Sall Mutationen in unterschiedlichen Organsystemen zugrunde liegende Gemeinsamkeiten herauszuarbeiten, die eine generelle Rolle von Sall Genen während der Embryonalentwicklung aufzeigen.

Sall4 ist der erste Sall Transkriptionsfaktor, der während der Embryonalentwicklung exprimiert wird. Die innere Zellmasse (IZM) der Blastula, aus der die embryonalen Stammzellen und das Extraembryonale Endoderm hervorgehen, exprimiert Sall4 besonders stark. Im Trophoblast hingegen wird die Transkription von Sall4 ab dem Tag e5.5 vollständig reprimiert. Die Deletion von Sall4 aus dem Mausgenom führt bei homozygoten Tieren zum Fehlen der beiden IZM Zellinien und damit zum Absterben des Embryos direkt nach der Einnistung in die Gebärmutter. Das Studium dieses Prozesses in einem Kultursystem bestätigte den sukzessiven Verlust der IZM und führte zu der Aussage, dass Sall4 für den Erhalt der embryonalen Stammzellen und des primitiven Endoderms notwendig ist. In Abwesenheit von Sall4 kommt es jedoch nicht zum Zelltod sondern zu reduzierter Zellteilung dieser Zellinien und zu deren Differenzierung. Auch embryonale Stammzellen verlieren in Kultur die Fähigkeit zur Zellteilung, wenn Sall4 deletiert wird.

Um zu testen, ob Sall4 die Identität von Zellen zellautonom steuert, wurden chimäre Mäuse aus Zellen mit und ohne Sall4 hergestellt. Dabei wurde festgestellt, dass Zellen, deren Sall4 Gen entfernt ist, auch im Verband mit Wildtyp-Zellen nicht zum Embryo beitragen können. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Funktion von Sall4 zellautonom ist.

I Zusammenfassung Im Gegensatz zum frühen Embryo werden in Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems alle vier Sall Gene abgelesen. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutation einzelner Gene nur milde Effekte auf die Entwicklung hat wohingegen das Entfernen mehrerer Sall Faktoren zu Verlust, Verkleinerung oder mangelnder Organisation verschiedener Bereiche des Nervensystems führt. Dies wurde auf die Beobachtung zurückgeführt, dass die Zellteilungsrate verringert ist. Beispiele hierfür sind die Grosshirnrinde und der Bulbus olfactorius. In Sall1/Sall2 Doppelmutanten kommt es so zum kompletten Verlust des Geruchssinns. Auch die wachsende Extremitätenknospe aktiviert mehrere Sall Gene, in späteren Stadien vor allem Sall1 und Sall3. Hier konnte gezeigt werden, dass die vollständige Ausbildung aller Elemente des Skeletts von der Dosis der Sall Aktivität abhängt und totale Abwesenheit von Sall1 und Sall3 Oligodaktylie zur Folge hat.

Mutation mehrerer Gene führt in Mäusen demnach zu Entwicklungsschäden vergleichbar denen, wie sie in Menschen, für TBS und DRRS beschrieben sind. Funktionen von Sall Faktoren überlappen stark. In allen untersuchten Entwicklungsprozessen kommt es in Abwesenheit aller hier exprimierten Sall Transkriptionsfaktoren zum Fehlen von differenzierten Zellen in den betroffenen Geweben, das sich nicht durch Zelltod sondern durch den Verlust der Vorläuferpopulation erklärt. Da Sall Proteine immer in Vorläufer- und Stammzellen aktiv sind lässt sich also ein allgemeines Modell postulieren, nachdem Sall Proteine für den Erhalt dieser nicht differenzierten Zellen nötig sind. Dieser Blickwinkel eröffnet neue Interpretationsmöglichkeiten für das Zustandekommen der Vielzahl an Missbildungen in TBS und DRRS.

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ZUSAMMENFASSUNG





TABLE OF CONTENTS

INTRODUCTION

1. THE SPALT-LIKE TRANSCRIPTION FACTOR FAMILY

1.1. ORTHOLOGS AND SIMILARITIES

1.2. PROTEIN STRUCTURE AND SUBCELLULAR LOCALIZATION

2. MUTATIONS IN SPALT-LIKE GENES CAUSE INHERITED DISEASES IN HUMANS

2.1. TOWNES-BROCKS SYNDROME (TBS)

2.2. OKIHIRO SYNDROME/RADIAL RAY SYNDROME

3. MUTATIONS IN SPALT AND SEM-4

4. SPALT-LIKE TRANSCRIPTION FACTORS AND CELL SIGNALLING

5. AIM OF THIS STUDY

RESULTS

1. COMPARISON OF SALL PROTEINS

1.1. COMPARATIVE EXPRESSION ANALYSIS OF SALL MRNA TRANSCRIPTS IN MOUSE

1.2. EXPRESSION DOMAINS OF SPALT LIKE PROTEINS OVERLAP.

2. GENERATION OF MOUSE LINES

2.1. KNOCKOUT VECTOR DESIGN FOR SALL2

2.2. ESTABLISHMENT OF A MOUSE LINE CARRYING A SALL2 NULL ALLELE

2.3. MICE MUTANT FOR SALL2 ARE VIABLE AND FERTILE

2.4. EGFP KNOCKIN OF SALL4

2.5. CONDITIONAL KNOCKOUT OF SALL4

2.6. THE FLOXED SALL4 ALLELE IS FUNCTIONAL

2.7. BREEDING AND STRAIN MAINTENANCE

3. SALL4 IS REQUIRED FOR PERIIMPLANTATION DEVELOPMENT

3.1. NO HOMOZYGOUS EMBRYOS WERE FOUND AT E10.5

III

Table of Contents

3.2. GENERATION AND TESTING OF AN ANTIBODY RAISED AGAINST MURINE SALL4

3.3. PRECISE EXPRESSION ANALYSIS FOR SALL4

3.4. IN VIVO ANALYSIS OF EMBRYOS DELETED OF SALL4

Sorting Embryos at Blastocyst Stage

Immunohistochemical Analysis of Expanded Blastocysts.

Histological Analysis at e6.5 and e7.5

Lineage Marker Analysis on Implantation Sites

3.5. EX VIVO ANALYSIS

Outgrowth of Blastocysts in Culture

Cell Types Present in Blastocyst Outgrowths

Cell Culture After Immunosurgery

Deletion of Sall4 from ES Cell Lines

3.6. SALL4 IS REQUIRED CELL AUTONOMOUSLY IN VIVO

Requirement for Sall4 in Inner Cell Mass Cells

Requirement of Sall4 in Primitive Endoderm

4. SALL1, SALL2 AND SALL3 FUNCTION IN NEUROGENESIS

4.1. LOSS OF SALL1 OR SALL3 RESULTS IN PERINATAL LETHALITY

4.2. MACROSCOPIC ANALYSIS

4.3. HISTOLOGICAL ANALYSIS OF THE OLFACTORY BULB IN MICE MUTANT FOR SALL1 AND SALL2.... 52

4.4. COMPARISON OF THE EFFECTS OF A LOSS OF SALL1, SALL2 AND SALL3 ON THE OLFACTORY BULB53

4.5. REMAINING MITRAL CELLS DO NOT PROJECT TO THE OLFACTORY CORTEX IN A SALL1/SALL2

DOUBLE KNOCKOUT

4.6. HISTOLOGICAL ANALYSIS OF THE NEOCORTEX IN A SALL1/SALL2 DOUBLE KNOCKOUT................ 58

4.7. BIRTHDATING OF NEURONS WITH BRDU

4.8. IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF THE SUBVENTRICULAR ZONE

4.9. ANALYSIS OF THE SPECIFICATION OF CORTICAL LAYERS I-VI

4.10. EXPRESSION OF THE INSERTED LACZ MARKER FROM THE GENOMIC LOCUS OF SALL1, SALL2 AND

SALL3

4.11. PRECISE EXPRESSION PATTERN OF SALL1 IN THE CNS

4.12. SYNERGISTIC EFFECTS OF SALL PROTEINS IN NEUROGENESIS

5. LOSS OF FUNCTION OF SALL1 AND SALL3 CAUSES OLIGODACTYLY

DISCUSSION

–  –  –

1. SALL TRANSCRIPTION FACTORS ARE EXPRESSED IN PROLIFERATIVE CELL POPULATIONS................ 77

2. A ROLE FOR SALL FACTORS IN STEM AND PROGENITOR CELL POPULATIONS

2.1. SALL4 IS REQUIRED FOR INNER CELL MASS FATE

2.2. EXPLANATIONS FOR APPEARANCE OF TROPHOBLAST IN SALL4-/- ICMS

2.3. WHAT COULD BE A MOLECULAR ROLE FOR SALL4 IN ES CELLS?

3. SALL FACTORS IN ADULT STEM CELLS

3.1. REDUNDANCY OF SALL1, SALL2 AND SALL3 IN OLFACTORY BULB DEVELOPMENT

3.2. LOSS OF SALL1 & SALL2 LEADS TO DEFECTS IN CORTICAL NEUROGENESIS

3.3. COULD PROGENITOR LOSS ACCOUNT FOR OTHER LATE PHENOTYPES?

4. MURINE COMPOUND KNOCKOUTS PARTIALLY RECAPITULATE HUMAN SYNDROMES CAUSED BY

MUTATIONS IN SALL GENES

ACKNOWLEDGEMENTS

MATERIALS AND METHODS

1. MATERIALS

1.1. CHEMICALS

1.2. EQUIPMENT, PLASTIC WARE AND OTHER MATERIALS

1.3. ENZYMES

1.4. MOLECULAR WEIGHT MARKERS

1.5. OLIGONUCLEOTIDES

Mouse Genotyping:

Southern Blot Probes

RT-PCR

1.6. ANTIBODIES

Primary Antibodies:

Secondary Antibodies:

1.7. PLASMID VECTORS

1.8. COMMERCIAL KITS

1.9. GENERALLY USED SOLUTIONS

1.10. CELLS

Bacterial Strains

V

Table of Contents

ES Cells

2. METHODS

2.1. DNA - PLASMIDS

Preparation of Plasmid DNA from Bacteria

Purification of Supercoiled DNA by CsCl Gradient Centrifugation

Spectrophotometric Determination of DNA and RNA Concentration

DNA Restriction and Klenow Treatment

Electrophoresis of DNA

Isolation and Purification of DNA from Preparative Agarose Gels

DNA Ligation

Preparation of Chemocompetent Escherichia coli XL-10 Cells

Transformation of Chemocompetent Escherichia coli XL-10 Cells

2.2. DNA - GENOMIC

Preparation of Genomic DNA

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Southern Blot Analysis

Radiolabelling of DNA Probes for Southern Blot Analysis

2.3. CELL CULTURE METHODS

Culture Conditions

Trypsinization of Cells

Mitomycin C Treatment of Mouse Embryo Fibroblasts

Freezing and Thawing Cells

Electroporation of ES Cells

Isolation of Individual ES Cell Colonies

De Novo Isolation of ES Cell Lines from Blastocysts

Immunosurgery

ES Cell Injection into Blastocysts and Chimera Production

2.4. TISSUE SECTIONING

Tissue Preparation and Fixation

Cryosectioning

Paraffin Embedding, Mounting and Sectioning

2.5. HISTOCHEMISTRY AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY

PAS Staining

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(2003). Expression of a truncated Sall1 transcriptional repressor is responsible for TownesBrocks syndrome birth defects. Hum Mol Genet 12, 2221-2227.



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