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«Direktor: Prof. Dr. med. Dr. sci. nat. C. Klein Einfluss des mTOR-Signalwegs auf die differentielle microRNA-Expression während der ...»

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Aus der Kinderklinik und Kinderpoliklinik

im Dr. von Haunerschen Kinderspital

der Ludwig-Maximilians-Universität München

Direktor: Prof. Dr. med. Dr. sci. nat. C. Klein

Einfluss des mTOR-Signalwegs auf die differentielle

microRNA-Expression während der Adipozytendifferenzierung

Dissertation

zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin

an der Medizinischen Fakultät der

Ludwig-Maximilians-Universität zu München

vorgelegt von

Andrea Oßwald

aus

München

II

Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität München Berichterstatter: Prof. Dr. med. Adelbert Roscher Mitberichterstatter: Priv. Doz. Dr. Bärbel Otto Priv. Doz. Dr. Beatrice Bachmeier Mitbetreuung durch die promovierte Mitarbeiterin: Dr. rer. nat. Julia von Frowein Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. M. Reiser, FACR, FRCR Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2012 III für meine Eltern IV V Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung

1.1 Adipositas

1.2 Adipogenese

1.3 Regulation der Adipogenese

1.3.1 „nutrient-sensing“ Signalwege

1.3.2 mTOR-Signalweg

1.3.3 Rolle des mTOR-Signalwegs in Adipogenese und Lipidstoffwechsel

1.3.4 microRNAs

1.3.5 Mechanismen der miRNA-induzierten Regulation von Zielgenen

1.3.6 Rolle von miRNAs in der Adipogenese

1.3.7 Regulatorische Rolle von miRNAs in Bezug auf „nutrient-sensing“

1.4 Ziele der Arbeit

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Reagenzien und Verbrauchsmaterial

2.1.2 Lösungen

2.1.3 Oligonukleotide

2.1.4 Kits und Assays

2.1.5 Glas- und Plastikmaterial

2.1.6 Geräte

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkultur

2.2.1.1 Kultivierung von 3T3-L1 Zellen

2.2.1.2 Passagieren von 3T3-L1 Zellen

2.2.1.3 Kryokonservierung von 3T3-L1 Zellen

2.2.1.4 Differenzierung von 3T3-L1 Zellen

2.2.1.5 Rapamycinbehandlung

2.2.1.6 Dokumentation der Zelldichte und der Differenzierung

2.2.1.7 Oil Red O Färbung

2.2.1.8 Zell-Ernte zur RNA-Extraktion

2.2.2 Molekularbiologische Methoden

2.2.2.1 RNA-Isolation und Bestimmung der RNA-Konzentration

2.2.2.2 cDNA-Synthese

2.2.2.3 Real-Time PCR

2.2.2.4 Semiquantitativer miRNA Microarray

VI 2.2.2.5 miRNA Microarray Statistik

2.2.2.6 Quantitativer „low density array”

2.2.2.7 miRNA Reverse Transkription

2.2.2.8 RT-PCR Quantifizierung von einzelnen miRNAs

2.2.3 Cluster- und Genfamilienzugehörigkeit

2.2.4 Bioinformatische Vorhersage von miRNA-Zielgenen

3 Ergebnisse

3.1 Charakterisierung des Modellsystems

3.2 miRNA-Expression während der Adipozytendifferenzierung

3.2.1 Microarray

3.2.2 Konfirmation mittels quantitativer „low density array”-Analyse

3.2.3 Vergleich der Arrayverfahren

3.3 Auswirkung von Rapamycin auf die Adipozytendifferenzierung

3.4 Auswirkung von Rapamycin auf die miRNA-Expression

3.4.1 Microarray

3.4.2 Konfirmation mittels quantitativer „low density array” -Analyse

3.4.3 Vergleich der Arrayverfahren

3.4.4 Expressionsgruppen

3.4.5 Zeitliche Abhängigkeit der miRNA-Expression

3.5 Cluster- und Genfamilienzugehörigkeit

3.6 Bioinformatische Vorhersage von miRNA-Zielgenen

4 Diskussion

4.1 Validierung der experimentellen Verfahren

4.1.1 Adipozytenmodellsystem

4.1.2 Validierung und Konfirmation von miRNA-Expressionsprofilen

4.1.3 Vorhersage von miRNA-Zielgen-Interaktionen

4.2 Differentielle miRNA-Expression während der Adipozyten-differenzierung

4.2.1 Neu identifizierte differentiell ausregulierte miRNAs

4.2.2 Konfirmierung von Vorbefunden

4.2.3 Cluster- und Genfamilienzugehörigkeit der miRNAs

4.3 Rapamycin-sensitive miRNAs

4.3.1 miRNA-Expressionsgruppen unter mTOR-Hemmung

4.3.2 Funktionelle Bedeutung der als Rapamycin-sensitiv ermittelten miRNAs

4.3.3 Vorhersage von miRNA-Zielgenen im mTOR-Signalweg

5 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen

6 Literaturverzeichnis

7 Anhang

VII 8 Abkürzungsverzeichnis

9 Danksagung

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Adipositas Adipositas ist definiert als eine über das normale Maß hinausgehende Akkumulation von Fettgewebe, die ein gesundheitliches Risiko darstellt. Sie beginnt, laut World Health Organization, ab einem „Body Mass Index“ (BMI = Gewicht in kg dividiert durch das Quadrat der Größe in m) von 30.

Adipositas hat sich zu einer der größten Herausforderungen des öffentlichen Gesundheitswesens im 21. Jahrhundert entwickelt. Seit den 1980er Jahren hat sich ihre Prävalenz in vielen Ländern Europas verdreifacht und die Zahl der Betroffenen steigt weiterhin mit alarmierender Geschwindigkeit an, besonders bei Kindern. Schon jetzt sind die Folgen von Adipositas für 2 - 8% der Gesundheitskosten und für 10 - 13% der Todesfälle in Europa mit verantwortlich (www.who.int).

Mit Adipositas sind diverse Komplikationen assoziiert: erhöhtes kardiovaskuläres Risiko, Bluthochdruck, Dyslipidämie, endotheliale Dysfunktion, Diabetes mellitus Typ II, gestörte Glucosetoleranz, Steatosis hepatis (Fettleber), Hypogonadismus, polyzystisches Ovarialsyndrom, obstruktives Schlafapnoesyndrom, orthopädische Komplikationen, Cholelithiasis und Pseudotumor cerebri (Barness et al. 2007), eventuell auch Krebs (Pan et al. 2009) und Inflammation (Mathieu et al. 2009).





Für die Adipositasentstehung sind u.a. multiple Mechanismen der Appetitregulation von Bedeutung, die jedoch nicht Gegenstand dieser Arbeit waren. Neuronale und hormonelle Signale wie Insulin und Leptin, die Informationen über vorhandene Nährstoffe enthalten, konvergieren im Hypothalamus und regulieren die Nahrungsaufnahme (Jordan et al. 2010).

Auf Ebene des Fettgewebes beruht die Entwicklung von Adipositas auf einem koordinierten Zusammenspiel von Adipozytenhypertrophie, Adipozytenhyperplasie und Angiogenese.

Entscheidend ist also nicht nur eine Zunahme der Zellgröße durch exzessive Lipidakkumulation (Hypertrophie), sondern auch eine erhöhte Anzahl an Fettzellen (Hyperplasie).

Man nimmt an, dass die Adipozytenhyperplasie während des ganzen Lebens erfolgt, und zwar sowohl im Rahmen des gewöhnlichen Zellumsatzes als auch als Antwort auf einen erhöhten Bedarf an zusätzlichen Fettspeichern, wenn die Kalorienzufuhr den Nährstoffbedarf überschreitet. Bei der Entstehung von Adipositas scheint die Hypertrophie der Hyperplasie voranzugehen (Avram et al. 2007).

Einleitung 2

1.2 Adipogenese Die Adipozytenhyperplasie, auch Adipogenese genannt, beinhaltet die Rekrutierung neuer Adipozyten aus Vorläuferzellen, den Präadipozyten (Hausman et al. 2001). Präadipozyten wiederum entstehen aus multipotenten mesenchymalen Stammzellen im Vorgang der sogenannten „Determination“ (siehe Abb. 1-1).

Abb. 1-1: Überblick über die Adipozytendifferenzierung, entnommen aus Gregoire et al. (1998).

Morphologisch unterscheiden sich Präadipozyten nicht von Stammzellen, aber sie haben die Fähigkeit zur Differenzierung in andere Zelltypen verloren (Rosen et al. 2006).

Bei der Adipogenese kommt es zur Proliferation und Differenzierung dieser Präadipozyten.

Die Proliferation führt zur Zunahme der Zellzahl von Präadipozyten durch Replikation.

Differenzierung hingegen bezeichnet die Umwandlung undifferenzierter, Fibroblastenähnlicher Präadipozyten in erwachsene, runde, lipidgefüllte Fettzellen (Hausman et al. 2001).

Einleitung 3 Dieser Vorgang ist charakterisiert durch die Expression einer Reihe von Transkriptionsfaktoren, die wiederum zur Expression spezifischer Gene führt und die lipogene Kapazität der Zellen erhöht (Butterwith 1994).

Ein wichtiger sequentiell aktivierter Transkriptionsfaktor ist „peroxisome proliferatoractivated receptor γ“ (PPAR-γ), der zur Familie der nukleären Rezeptoren gehört. Er ist sowohl notwendig als auch hinreichend zur Induktion der Adipogenese. Die meisten proadipogenen Faktoren wie die „CCAAT-enhancer-binding Proteine“ (C/EBP) und „Krüppel-like Faktoren“ (KLF) (siehe unten) scheinen mindestens einen der beiden PPAR-γPromotoren zu induzieren. PPAR-γ ist sowohl für die Induktion der Adipogenese als auch für die Aufrechterhaltung des differenzierten Zellstatus notwendig.

Neben PPAR-γ sind auch einige Mitglieder der C/EBP-Familie an der Adipogenese beteiligt.

Aufgrund der temporären Expression dieser Transkriptionsfaktoren während der Differenzierung nimmt man an, dass es sich um eine Kaskade handelt, bei der die Induktion von C/EBP-β und C/EBP-δ zur Induktion von C/EBP-α führt. C/EBP-α wiederum induziert die Expression vieler Adipozytengene auf direktem Weg. Bei Abwesenheit von PPAR-γ können die C/EBPs die Adipogenese jedoch nicht effizient vorantreiben.

Schließlich ist auch eine Kaskade von „Krüppel-like Faktoren“ an der Regulation der Adipozytendifferenzierung beteiligt. Die KLFs sind eine große Familie von C2H2 Zinkfinger Proteinen, die Apoptose, Proliferation und Differenzierung regulieren. KLF5 wird in der frühen Adipozytendifferenzierung durch C/EBP-β und C/EBP-δ induziert. Daraufhin bindet KLF5 an den PPAR-γ-2 Promoter und aktiviert ihn zusammen mit den C/EBPs. KLF6 inhibiert die Expression des „deltalike-1/pre-adipocyte factor-1“ (DLK1/Pref-1) bei 3T3-L1 Zellen und Fibroblasten (Rosen et al. 2006). Pref-1 ist ein Präadipozytenmarker, den nur undifferenzierte 3T3-L1-Zellen exprimieren (Smas et al. 1998).

Neben PPAR-γ, den C/EBPs und KLFs spielen noch eine Reihe anderer Transkriptionsfaktoren bei der Förderung der Adipozytenentwicklung eine Rolle. Auf der anderen Seite existierten aber auch anti-adipogene Transkriptionsfaktoren, die die Adipogenese unterdrücken. Hierzu gehören u.a. KLF2 und KLF7 (Farmer 2006; Rosen et al. 2006).

Nach vollendeter terminaler Differenzierung besitzt der Adipozyt die zelluläre Ausstattung, die für Lipidtransport und Lipidsynthese, Insulinsensitivität und die Sekretion Adipozytenspezifischer Proteine nötig ist (Rosen et al. 2006). Dann nehmen die Zellen durch zusätzliche Lipidakkumulation nur noch an Größe zu (Avram et al. 2007). Die terminale Differenzierung ist charakterisiert durch die Expression von Adipozytentypischen und -spezifischen Genen wie „fatty acid binding protein 4“ (FABP4=aP2), „adipsin“ (complement factor D), Einleitung 4 “adiponectin, C1Q and collagen domain containing” (ADIPOQ) und Leptin (Avram et al.

2007).

Unter den vielen möglichen Genen haben sich C/EBP-α, PPAR-γ und Pref-1 als zuverlässige Marker für die Adipozytendifferenzierung bewährt (MacDougald et al. 1995).

3T3-L1-Zellen Zum Studium der molekularen Vorgänge während der Adipozytendifferenzierung wurden verschiedene Modellsysteme geschaffen. In den 1970er Jahren haben Green et al. (1974) eine Subpopulation von Präadipozyten von disaggregierten, 17 bis 19 Tage alten Swiss Mausembryonen geklont. Die entstandene 3T3-L1-Zelllinie ist ein gut geeignetes in vitro Modellsystem, um die molekularen Mechanismen der Adipogenese zu untersuchen (Ntambi et al. 2000). Sie ist eines der am umfassendsten charakterisierten und am weitesten verbreiteten Zellmodelle der Adipogenese. Durch die Zugabe von Insulin, Dexamethason und Isobutylmethylxanthin (IBMX) sowie fetalem Kälberserum differenzieren die 3T3-L1Präadipozyten zu Adipozyten (Cornelius et al. 1994).

1.3 Regulation der Adipogenese

1.3.1 „nutrient-sensing“ Signalwege Nährstoffe wie Glucose, Aminosäuren und Fettsäuren wurden lange Zeit nur als Energielieferanten zur ATP-Gewinnung angesehen. Neuere Befunde zeigen jedoch, dass Glucose und Aminosäuren auch als Signalmoleküle in komplexen „nutrient-sensing transductional pathways“ oder „nutrient-sensing signaling pathways“ dienen. Die „nutrient-sensing pathways“ triggern Signalkaskaden, die verschiedene Anteile des Energiemetabolismus regulieren und beeinflussen so Zellwachstum, Proliferation und Überleben. Diese Signalwege bestehen aus 2 Komponenten: einem Sensor, der Veränderungen in der Nährstoffverfügbarkeit detektiert und einem Transduktionselement typischerweise ein Enzym -, das regulatorische Proteine z.B. durch Phosphorylierung modifiziert. Zu den drei am besten erforschten, funktionell verschiedenen „nutrient-sensing“Signalwegen gehören der Hexosamin-Signalweg, der „mechanistic target of rapamycin“ (mTOR)-Signalweg und der Adenosinmonophosphat-aktivierte Proteinkinase (AMPK)Signalweg (Marshall 2006).

Einleitung 5 1.3.2 mTOR-Signalweg In unserer Arbeit wurde der Fokus auf den mTOR-Signalweg gelegt, der in der Onkologie gut erforscht ist und für den eine Reihe von Inhibitoren für den experimentellen Einsatz zur Verfügung steht. Im Zusammenhang mit „nutrient-sensing“-Regulation ist dagegen relativ wenig bekannt, insbesondere in Bezug auf eine Modulierbarkeit des mTOR-Signalwegs mittels miRNAs oder Diätetik.

MTOR ist eine Proteinkinase, die von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist, und Signalnetzwerke, die für Zellwachstum, Proliferation, Differenzierung und Überleben essentiell sind, integriert (Zhang et al. 2009b). MTOR besteht aus 2 getrennten Multiproteinkomplexen – „mTOR complex 1“ (mTORC1) und „mTOR complex 2“ (mTORC2). MTORC1 besteht aus mTOR, Raptor (regulatory associated protein of mTOR) und LST8.

Der mTOR-Signalweg (siehe Abb. 1-2) vermittelt Veränderungen der Nährstoffverfügbarkeit, der intrazellulären Energiespiegel sowie des extrazellulären Milieus z.B. durch die Bindung von Insulin, Leptin und Adiponectin an membranständige Rezeptoren (Marshall 2006).



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