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«Einfluss der Hemmung des Proteasomen-Komplexes auf die proinflammatorischen Effekte der Cyclooxygenase-2 in glomerulären Mesangiumzellen ...»

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Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

Zentrum für Innere Medizin

III. Medizinische Klinik und Poliklinik

Prof. Dr. med. Rolf A. K. Stahl

Einfluss der Hemmung des Proteasomen-Komplexes

auf die proinflammatorischen Effekte der Cyclooxygenase-2

in glomerulären Mesangiumzellen

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

Der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg

vorgelegt von:

Katharina Großer

aus Hamburg

Hamburg 2009 Angenommen von der Medizinischen Fakultät am: 17.05.2010 Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg Prüfungsausschuss, der Vorsitzende: Prof. Dr. F. Thaiss Prüfungsausschuss, 2. Gutachter/in: PD R. K. Ruckdeschel Prüfungsausschuss: 3. Gutachter/in: Prof. Dr. U. Schumacher Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 7 Abbildungsverzeichnis 10 Tabellenverzeichnis 11 1 Einführung 12

1.1 Cyclooxygenasen (COX) und ihre Funktionen............. 12 1.1.1 Bedeutung der Cyclooxygenase-2 (COX-2)........... 13 1.1.2 Rolle der COX-2 für Glomerulonephritiden (GN)....... 14 1.1.3 Überexpression der COX-2 in Mesangiumzellen........ 15

1.2 Regulation des Chemokin CCL2..................... 15 1.2.1 Bedeutung des Transkriptionsfaktors NF-κB.......... 16 1.2.2 Bedeutung des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS)...... 19 1.2.3 Proteasomenhemmer zur Inhibition von NF-κB........ 20 1.2.4 Bedeutung des Transkriptionsfaktors AP-1........... 20

1.3 Arbeitshypothese und Fragestellung................... 21 2 Mate

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A Adenin Abb. Abbildung Ak Antikörper AP-1 Activator Protein-1 APS Ammoniumpersulfat ATF Activating Transcription Factors ATP Adenosintriphosphat Bis Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan bp Basenpaare BP Blocking Puffer °C Grad Celsius C Cytosin CaCl2 Calciumchlorid cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat CBP CREB-Binding Protein CCL2 CC-Chemokin 2 (MCP-1) cDNA Komplementäre DNA (Complementary DNA) Ci Curie cm Zentimeter COX Cyclooxygenase COX-2+ COX-2-überexprimierende Zellen Cpm Counts per minute CRE cAMP Response Element CREB CRE-binding protein Ct Schwellenwert-Zyklus (Threshold Cycle) dH2 O destilliertes Wassser DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Desoxynukleotide DTT Dithiothreitol DUBs Deubiquitylating enzymes EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglycol-bis-(2-aminoethylether) EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay FACS Durchflusszytometrie (Fluorescence Activated Cell Sorting) FCS Fötales Kälberserum (Fetal Calf Serum) FITC Fluorescein-5-Isothiocynat g Gramm; Vielfaches der Erdbeschleunigung (× g) G Guanin GBM Glomeruläre Basalmembran GN Glomerulonephritis h Stunde(n) HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure IκB Inhibitor κB Ig Immunglobulin IH Immunhistologie IL Interleukin iNOS induzierbare NO-Synthase IP Immunpäzipitation k Kilo K Lysin kb Kilo-Basenpaare kDa Kilo-Dalton LPS Lipopolysaccharid luc Luciferase m Meter; Milli M Molar MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1; CCL2 ß-ME ß-Mercaptoethanol MG MG-132 MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute MLN MLN-273 MOPS Morpholinosulfonsäure mRNA messenger RNA MZ Mesangiumzellen n Anzahl NF-κB Nukleärer Faktor-κB NF-IL6 Nukleärer Faktor-Interleukin 6 nm Nanometer NO Stickstoffmonoxid PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese P Phosphor PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerasekettenreaktion PDGF Platelet Derived Growth Factor PG Prostaglandin PMSF Phenylmethansulfonylfluorid RHD Rel Homology Domain RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute PCAF p300/CBP-associated factor rRNA ribosomale Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur s Sekunde SD Standardabweichung (Standard Deviation) SDS Natriumdodecylsulfat T Thymin Tab. Tabelle TATA Thymin-Adenin-Thymin-Adenin TAD Transaktivierungsdomänen TBE Tris-Borsäure-EDTA Puffer TE Tris-EDTA Puffer TEMED Tetramethylethylendiamin TLR-4 Toll-like Rezeptor-4 TNF-α Tumor-Nekrosefaktor-α TPE TPA-Responsive Element TrisCl Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U Unit(s) UV ultraviolett V Volt VK Vektorkontroll-Zellen

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1 Einführung

1.1 Cyclooxygenasen (COX) und ihre Funktionen Meist belehrt erst der Verlust über den Wert der Dinge.

Arthur Schopenhauer, 22.02.1788 - 21.09.1860 [42] Die COX wurde im Jahre 1976 erstmals aus Samenbläschen von Rind und Widder isoliert [8, 24]. Seit der Entdeckung eines zweiten Genproduktes mit Cyclooxygenaseaktivität Anfang der 90er Jahre wird die konstitutiv-exprimierte COX-1 von der induzierbaren COX-2 unterschieden [4, 20, 43]. Zudem ist seit 2002 ein drittes Isoenzym Gegenstand aktueller Untersuchungen. Das Genprodukt der COX-3 wird im Menschen überwiegend kardial und zerebral exprimiert. Aktuellen Literaturempfehlungen zufolge sollte die COX-3 bevorzugt als COX-1b bzw. COX-1 Variante 1 (COX-1V1) bezeichnet werden [1, 54].

Cyclooxygenasen regulieren eine Vielzahl sowohl physiologischer als auch pathophysiologischer Prozesse im menschlichen Organismus. An Hand der Effekte, die aus dem Funktionsverlust der COX resultieren, lässt sich die Bedeutung derselben für den menschlichen Organismus abschätzen. Die COX entfaltet ihre Wirkungen über parakrin wirkende Gewebshormone, die sogenannten Prostanoide. Unter dem Begriff Prostanoide werden Prostaglandine (PG), Thromboxane sowie das als Prostazyklin bezeichnete PGI2 zusammengefasst. Als bifunktionelles Schrittmacherenzym der Prostanoidsynthese katalysiert die COX zunächst die oxidative Zyklisierung von freier Arachidonsäure zu dem Zwischenprodukt PGG2. Durch die Peroxidaseaktivität der COX wird PGG2 in einem zweiten Schritt zu PGH2 überführt [51]. Im Anschluss katalysieren verschiedene Prostaglandin-Synthasen die Umwandlung des instabilen PGH2 in die biologisch aktiven Endmetabolite. Welche Prostanoide produziert werden, variiert in Abhängigkeit von den im jeweiligen Kontext an die COX assoziierten Prostaglandin-Synthasen [3].





Die beiden Gene COX-1 und COX-2 liegen auf Chromosom 9 und 1. Während die Gene mit 22 kb für COX-1 und 8,3 kb für COX-2 in ihrer Größe erheblich voneinander abweichen, unterscheiden sich die Proteine mit einem Molekulargewicht von 70 kDa und einer zu 67 % homologen Primärstruktur nur unwesentlich. Beide Isoenzyme sind in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum sowie im inneren und äußeren Blatt der Kernhülle lokalisiert [44] und katalysieren die gleiche Reaktion [54]. Die COX-1 ist in den meisten Zellen konstitutiv exprimiert. Über ihre Endprodukte hat die COX-1 wichtige physiologische Funktionen für die gastrointestinale Integrität der Mukosa, die Plättchenaggregation und die Regulation des renalen Blutflusses [10].

Für die Erkenntnis, dass der Wirkmechanismus von Aspirin und anderen NSAID auf einer Hemmung der COX beruht, wurde Sir John Vane im Jahre 1982 mit einem Nobelpreis ausgezeichnet. NSAID werden als nicht-selektive COX-Inhibitoren klinisch zur Analgesie, Fiebersenkung und Entzündungshemmung eingesetzt. Ferner wird die funktionelle Ausschaltung der COX auch zur Thrombozytenaggregationshemmung therapeutisch genutzt. Darüber hinaus wurde in verschiedenen Publikationen eine antikanzerogene Wirkung von NSAID insbesondere bei kolorektalen Karzinomen diskutiert [58]. Andere Untersuchungen konnten eine neuroprotektive Wirkung von NSAID bei der Demenz vom Alzheimer-Typ aufzeigen [52].

Aus dem Spektrum unerwünschter Arzneimittelwirkungen von NSAID lassen sich weitere Funktionen der COX im menschlichen Körper ableiten. So kann die Inhibition der COX zur Schädigung der gastrointestinalen Mukosa führen, eine Nierenfunktionsstörung hervorrufen und durch Leukotrien-Shift das sogenannte AnalgetikaAsthma auslösen.

Auch wenn das Auftreten kardiovaskulärer Zwischenfälle in Zusammenhang mit Rofecoxib [26, 63] nicht mehr als generelles Problem von COX-2-selektiven Inhibitoren angesehen wird, sondern sich vielmehr aus dem spezifischen Risikoprofil einzelner Substanzen ergibt [46], so liefern diese Beobachtungen doch weitere Evidenz für die umfassende Rolle, die die COX im menschlichen Organismus spielt.

1.1.1 Bedeutung der Cyclooxygenase-2 (COX-2)

Die COX-2 wurde zunächst als induzierbares Enzym mit rein pathophysiologischer Bedeutung von der ubiquitär exprimierten COX-1 abgegrenzt. Die antiinflammatorische, analgetische sowie antipyretische Wirkung von NSAID wird einer Inhibition der COX-2 zugeschrieben. Bei einer Vielzahl inflammatorischer Prozesse und Erkrankungen wie beispielsweise der Rheumatoiden Arthritis, Osteoarthrose [3] sowie verschiedenen Glomerulonephritiden [19] wurde eine Induktion der COX-2 beobachtet. Weiter konnte auch eine pathophysiologische Rolle der COX-2 bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer [52] und der Entstehung von kolorektalen Karzinomen [58] herausgearbeitet werden.

Die Beobachtung, dass die Defizienz des COX-2 Gens in Mäusen renale Dysplasien, kardiale Fibrosen und Infertilität weiblicher Individuen hervorruft [2], lieferte wichtige Hinweise dafür, dass die COX-2 auch im menschlichen Organismus neben der krankheitsverursachenden Potenz noch physiologische Funktionen haben könnte. So wurde nachgewiesen, dass die COX-2 in verschiedenen humanen Geweben wie in Gehirn [51] und Niere [54] auch konstitutiv exprimiert wird. Die konstitutive Expression in der Niere scheint unter anderem für die Reninsekretion [10] und die Regulation des Salzhaushaltes [7] bedeutsam zu sein.

In der Frühphase inflammatorischer Prozesse wird die Expression der COX-2 in verschiedenen Zelltypen wie Endothelzellen, Fibroblasten, glatten Muskelzellen, Monozyten und Mesangiumzellen massiv hochreguliert [41, 51]. Die COX-2 wird daher zu den sogenannten Immediate-Early Genes gezählt [10]. Definitionsgemäß umfasst die Gruppe der Immediate-Early Genes zelluläre Gene, deren Transkription innerhalb von Minuten durch extrazelluläre Signalstoffe transient induziert werden kann, ohne dass hierzu eine de novo Proteinsynthese zur Induktion des Genes nötig ist [45, 50].

Die COX-2 wird experimentell durch eine Vielzahl von Substanzen wie LPS, Wachstumsfaktoren und proinflammatorische Zytokine induziert. Durch die Anwesenheit von Glukokortikoiden kann die Induktion der COX-2 durch extrazelluläre Stimuli verhindert werden [10]. Die experimentelle Induzierbarkeit der COX-2 wird durch verschiedene regulatorische Elemente wie eine TATA-Box, ein cAMP Response Element (CRE), zwei NF-κB Konsensussequenzen, eines NF-IL6 Motivs sowie einer E-Box vermittelt [25, 49].

1.1.2 Rolle der COX-2 für Glomerulonephritiden (GN)

Glomerulonephritiden gehören zu den weltweit häufigsten Ursachen der terminalen Niereninsuffizienz, die auch als End-stage Renal Disease bezeichnet wird [14].

Diese führt zu einer erheblichen Verminderung der Lebenserwartung, ruft bei betroffenen Patienten eine Vielzahl von Begleit- und Folgeerkrankungen hervor und beeinträchtigt die Lebensqualität gravierend. Zudem verursacht die bei der Gruppe der terminal niereninsuffizienten Patienten erforderliche Nierenersatztherapie erhebliche Kosten für das Gesundheitssystem [56].

Aus den genannten Gründen ist es von großer klinischer Relevanz, die pathophysiologischen Mechanismen, die Glomerulonephritiden zugrunde liegen, besser zu verstehen. Die Ätiologie von GN ist multifaktoriell und bisher nicht bis ins Detail verstanden. Verschiedene Formen einer GN wie zum Beispiel die IgA-Nephropathie gehen mit einer starken Mesagiumproliferation einher [14].

Im Rahmen experimenteller und humaner GN wird die COX-2 transient hochreguliert [19]. In vitro kann eine COX-2 Expression in Ratten-Mesangiumzellen durch inflammatorische Mediatoren wie IL1, LPS und Serotonin induziert werden [41].

Die Rolle der COX-2 für die Pathogenese von GN ist jedoch komplex. So scheint die COX-2 nicht nur proinflammatorisch zu wirken, sondern auch resolutionsfördernde Effekte für glomeruläre Entzündungen zu haben. Als möglicher Mechanismus wird die Umschaltung von proinflammatorischen Prostanoiden zu antiinflammatorisch wirksamen COX-2 Metaboliten diskutiert [5].

1.1.3 Überexpression der COX-2 in Mesangiumzellen

Durch Mesangiumzellen, die COX-2 konstitutiv überexprimieren (COX-2+), konnte in der Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die COX-2 sowohl einen Effekt auf die Expression proinflammatorischer Gene als auch einen Einfluss auf das Proliferationsverhalten der Zellen hat. Die Behandlung mit dem Wachstumsfaktor PDGF führt in COX-2+ Zellen zu einer verminderten Proliferationsfähigkeit, welche auf einen reduzierten Gehalt an Reaktiven Sauerstoffspezies zurückgeführt werden konnte [61, 62].

Neben dem Proliferationsverhalten von COX-2+ Zellen wurde in der Arbeitsgruppe der Einfluss einer COX-2 Überexpression auf proinflammatorische Gene wie CCL2 und CCL5 untersucht. Die Behandlung mit LPS bewirkt in den COX-2+ Zellen einen hyperinflammatorischen Effekt, der sich in einer starken Expressionssteigerung proinflammatorischer Gene wie CCL2 oder CCL5 äußert [60].

1.2 Regulation des Chemokin CCL2 Das Chemokin CCL2 gehört zur Familie der CC-Chemokine und wird auch als Monozyten Chemoattraktives Protein-1 (MCP-1) bezeichnet.

CCL2 spielt in vivo bei verschiedenen inflammatorischen Prozessen eine Rolle wie bei der Rheumatoiden Arthritis, Arteriosklerose und GN [31]. Sezerniert wird CCL2 sowohl von leukozytären Zellen wie Monozyten als auch von nicht-leukozytären Zellen wie beispielsweise residenten Nierenzellen [53]. CCL2 entfaltet seine Wirkungen über die Chemokinrezeptoren CCR2 und CCR11 [57].

Wie die COX-2 wird auch CCL2 zu den Immediate-Early Genes gezählt [45]. So wird die Expression von CCL2 durch LPS, PDGF, TNF-α und anderen Mediatoren in verschiedenen Zelltypen induziert [36].

Untersuchungen an Patienten mit entzündlichen Nierenerkrankungen haben ergeben, dass CCL2 im Rahmen inflammatorischer Prozesse glomerulär und tubulär hochreguliert wird. Die Schwere tubulärer Läsionen und das Ausmaß einer monozytären Infiltration der Glomeruli korreliert dabei mit der Konzentration von CCL2 im Urin [35].



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