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«Rabies-Virus-Infektion der Maus: Einfluss des viralen Glykoproteins auf die Immunantwort im ZNS. INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des ...»

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Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie

der Philipps-Universität Marburg

Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. E. Weihe

Arbeitsgruppe Molekulare Neurowissenschaften

in Zusammenarbeit mit dem

Department of Microbiology & Immunology

der Thomas Jefferson Universität Philadelphia

Direktor: T. L. Manser, PhD

M. J. Schnell, PhD & B. Dietzschold, DVM

Rabies-Virus-Infektion der Maus: Einfluss des viralen

Glykoproteins auf die Immunantwort im ZNS.

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Doktorgrades der Humanmedizin (Dr. med.) dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Tilman Krieger aus Kassel Marburg, 2010 Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg am 16.12.2010 gedruckt mit der Genehmigung des Fachbereiches.

Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund Referent: PD Dr. M. Bette Koreferent: PD Dr. G. Höglinger Gewidmet meinen Eltern in Dankbarkeit Staunen ist der erste Schritt zu einer Erkenntnis.

Louis Pasteur Inhaltsverzeichnis Abkürzungen IV 1 Zusammenfassung 1

1.1 Deutsche Zusammenfassung..................... 1

1.2 Englische Zusammenfassung..................... 2 2 Einleitung 3

2.1 Das Rabies-Virus (RV)........................4 2.1.1 Taxonomie..........................4 2.1.2 Aufbau des Rabies-Virus...................4 2.1.3 Übertragungswege......................7 2.1.4 Krankheitsverlauf.......................8 2.1.5 Diagnose...........................9 2.1.6 Therapie........................... 11

2.2 Immunreaktionen bei Rabies-Virus-Infektion...........

–  –  –

1.1 Deutsche Zusammenfassung Das Glykoprotein des Rabies-Virus (RV-G) spielt durch die Beeinflussung der Neuroinvasivität und durch die Modulation antiviraler Immunreaktionen eine zentrale Rolle bei der Rabies-Virus-Erkrankung (Tollwut). Bisher ist noch nicht bekannt, durch welchen Mechanismus RV-G die Pathogenität des Virus beeinflusst, wenn dieses das ZNS erreicht hat. Um die Bedeutung der RV-G-Expression im ZNS zu untersuchen, infizierten wir Mäuse intranasal mit attenuierten Rabies-Viren des Stammes SPBN sowie mit Viren des Stammes SPBN-DOG4; dieser Stamm unterscheidet sich von SPBN insofern, als dass die für RV-G kodierende Gensequenz gegen die des hoch pathogenen Wildtyp-Stammes DOG4 ersetzt worden ist. Bei intramuskulärer Inokulation von SPBN überlebten alle der infizierten Mäuse, bei SPBN-DOG4 führte dies zu einer Mortalitätsrate von 30%. Bei intranasaler Inokulation hingegen führte die Infektion zu einer jeweiligen Mortalitätsrate von 100%.

Die mittlere Überlebenszeit war dabei in der SPBN-Gruppe signifikant gegenüber der SPBN-DOG4-Gruppe erniedrigt, was aufgrund der beschleunigten Krankheitsprogression auf eine erhöhte Pathogenität von SPBN hinweist. Bei den mit SPBN infizierten Tieren fand sich zudem ein erniedrigter Spiegel von IL-6, von Virusneutralisierenden Antikörpern sowie eine verminderte Glia-Aktivierung. Diese verminderten immunologischen Abwehrreaktionen korrelierten mit einem verminderten Virus-Titer und einer verminderten globalen RV-G- und RibonukleoproteinExpression im gesamten ZNS. Bei der Quantifizierung der Virusmenge in einzelnen Neuronen konnte jedoch festgestellt werden, dass die zelluläre RV-G-Expression in der SPBN-Gruppe signifikant erhöht war. Dieser neue Befund zeigt klar, dass die zellulären Expressionspiegel und weniger die globale Viruslast im Gehirn wesentlich zu der Pathogenität des Rabies-Virus beitragen. Aufgrund dieser Daten könnte die Entwicklung von Behandlungsschemata, die zu einer Blockade der Expression von RV-G in einzelnen Neuronen führen, ein neues therapeutisches Konzept bei der Behandlung der Rabies-Virus-Erkankung darstellen.

1.2 Englische Zusammenfassung

The rabies virus glycoprotein (RV-G) plays a central role in the pathogenesis of rabies by determining the neuroinvasiveness and by modulating antiviral immune responses. The mechanism by which RV-G determines the pathogenicity once the virus has reached the brain is still unknown. To study the role of RV-G in the CNS, we infected mice intranasally with the attenuated rabies virus variant SPBN or with the recombinant RV variant SPBN-DOG4. In SPBN-DOG4, the RV-G gene sequence of SPBN was replaced by that of the highly pathogenic street virus strain DOG4. Intramuscular inoculation resulted in 30% mortality in SPBN-DOG4infected but not in SPBN-infected mice whereas intranasal inoculation of both RV variants resulted in 100% mortality. The mean time of survival was significantly lower in SPBN-infected mice as compared to those infected with SPBN-DOG4.

These findings indicate a higher pathogenicity of the SPBN virus strain. Significantly lower virus neutralizing antibody serum titers and IL-6 mRNA levels in the brain and reduced glial activation paralleled the reduced mean time of survival of SPBN-infected animals. Additionally, a correlation with lower virus titers, reduced levels of RV-G and ribonucleoprotein expression in whole brain homogenates could be found. However, on the level of single infected neurons the amount of RV-G was higher in SPBN-infected mice. These data suggest that higher RV-G expression levels in individual infected neurons rather than the overall number of infected neurons defines the pathogenicity of a rabies virus strain. By limiting the cellular RV-G-expression in the brain, new therapeutical concepts in treatment of rabies virus infection could be developed.





2 Einleitung Der experimentelle Teil dieser Arbeit wurde teils am Institut für Anatomie und Zellbiologie der Philipps-Universität Marburg, teils am Department of Microbiology and Immunology der Thomas-Jefferson-University Philadelphia, PA, USA, durchgeführt. In Philadelphia wurde mir ermöglicht, das für die Arbeit mit infektiösen Viren und infizierten Tieren notwendige Sicherheitslabor der Stufe BSL 3 zu benutzen.

Alle Tierexperimente wurden unter einheitlicher Tierpflege und unter Verwendung von Protokollen der American Association for Animal Science (AALAS) durchgeführt. Animal Welfare Assurance Number: A3085-01.

Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten wurden zur Publikation eingereicht. Sofern nicht anders bezeichnet, handelt es sich bei allen Grafiken um eigene fotografische Aufnahmen, Darstellungen bzw. Zeichnungen.

Die folgenden Ausführungen bedürfen grundlegenden Definitionen:

• Rabies-Virus Wildtyp-Stamm (Rabies virus street virus srain): Ein VirusStamm, der aus Tieren isoliert wurde, welche auf natürliche Weise infiziert wurden (beispielsweise Hunde oder Füchse).

• Pathogener Rabies-Virus-Stamm: Ein Virus-Stamm, der nach peripherer Inokulation eine Rabies-Virus-Infektion (Tollwuterkrankung) auslöst.

• Attenuierter Rabies-Virus-Stamm: Ein Virus-Stamm mit stark reduzierter Fähigkeit, nach peripherer Inokulation eine Tollwuterkrankung im infizierten Tier auszulösen [158].

2.1 Das Rabies-Virus (RV) 2.1.1 Taxonomie Das Rabies-Virus (RV) ist ein streng neurotropes Virus aus der Familie der Rhabdoviridae. Diese umfasst die zwei Gattungen der Vesiculoviridae sowie die der Lyssaviridae [140]. Als ein bedeutsamer Vertreter der Vesiculoviridae ist das Vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) zu nennen. Bei dem Rabies-Virus handelt es sich um ein Einzel(-)-Strang-RNA-Virus (ss(-)RNA) aus der Gattung der Lyssaviridae [87] (s.

Abb. 1). Die Rabies-Viren werden wiederum in zwei Phylogruppen mit insgesamt 11 Genotypen eingeteilt [61, 124]. Genotyp 1 ist für die meisten Infektionen und Todesfälle bei Menschen und Tieren verantwortlich [124].

Abbildung 1: Die Gattung der Lyssaviridae mit ihren 7 Genotypen. Leicht modifizierte Abbildung aus [87].

2.1.2 Aufbau des Rabies-Virus Die Hülle des Rabies-Virus wird durch die Membran und das innen anliegende MProtein gebildet. Im Inneren befindet sich die virale RNA, die durch N-Protein in einer helikalen Struktur gehalten wird (s. Abb. 2).

Rabies-Viren haben ein kleines Negativ-Strang RNA-Genom der Größe von ca.

12kb. Dieses kodiert die fünf Proteine Nukleoprotein (N), Phosphoprotein (P), Matrixprotein (M), Glykoprotein (G bzw. im Folgenden auch mit RV-G bezeichnet) und das Large-(L)-Protein [27, 87, 171] (für eine schematische Darstellung s. Abb.

2).

Das P-Protein ist ein Cofaktor der L-Polymerase und wird für die RNA-Einkapselung benötigt [30, 71]. Ein Komplex aus einem L-Protein und drei P-Proteinen fungiert bei der Virusreplikation als RNA-abhängige RNA-Polymerase, welche die genomische (-)-RNA in mRNA transkribiert. P- und L-Protein sind gemeinsam mit dem helikalen Ribonukleoprotein-(RNP)-Komplex assoziiert, welches sich bei allen Mitgliedern der Familie der Rhabdoviridae wiederfindet [62]. Bei der Abkapselung der Viren werden diese RNP-Komplexe von einer membranösen Hülle umschlossen, deren Innenseite mit M-Proteinen ausgekleidet ist [113]. Die Ausbildung von RNP-M-Komplexen ist für ein effektives Abkapseln (Budding) von Virus-Partikeln essenziell [112, 113]. Des weiteren sind in der Virus-Hülle trimere TransmembranProteine verankert, die mit dem RV Glykoprotein (RV-G) assoziiert sind. Dieses nach außen hin präsentierte RV-G fungiert durch die Interaktion mit Zellrezeptoren und die Förderung der Virus- und Zellmembranfusion als ein wesentlicher Faktor für die Virus-Aufnahme in Neurone [39, 50, 103]. Zudem bestimmt der Phänotyp des RV-G maßgeblich die Neuroinvasivität des RV, also dessen Fähigkeit, von einer peripheren Inokulationsstelle (z.B. dem Skelettmuskel) in das Zentrale Nervensystem (ZNS) zu migrieren [12,40,50,108,120,163]. Schon geringfügige Veränderungen der Aminosäuresequenz des RV-G können zu ausgeprägten Veränderungen der Pathogenität des RV führen; so kann aus einem pathogenen ein nicht-pathogener Phänotyp entstehen und umgekehrt. Es führt z.B. eine Mutation an Position 333 des Virus-Genoms (Mutation von Arginin zu Glutamat) zu einer Veränderung der antigenetischen Stelle 3 des RV-G. In der Folge verlieren die mutierten Viren ihre Fähigkeit, bei peripherer Infektion eine tödlich verlaufende RV-Erkrankung in adulten immunkompetenten Mäusen hervorzurufen. Wahrscheinlich ist die Ausbreitung der Viren von der peripheren Inokulationsstelle ins ZNS beeinträchtigt, so dass eine Infektion des ZNS ausbleibt [40, 108, 111]. Variationen an anderen Stellen der Aminosäuresequenz der antigenetischen Stelle 3 des Glykoproteins im Bereich der Positionen 164 bis 303 scheinen ebenfalls großen Einfluss auf die Pathogenität auszuüben [77].

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Aufbaus des Rabies-Virus. Orientiert an einer Abbildung in [22].

Für die am Department of Microbiology and Immunology in Philadelphia durchgeführten Versuche verwendeten wir die Virus-Stämme SPBN sowie SPBN-DOG4.

Genetisch unterscheiden sich diese Stämme in der Sequenz des Glykoproteins (s.

Abb. 3). SPBN-DOG4 verfügt über die Glykoprotein-Gensequenz des hochpathogenen Wildtyp-RV-Stammes DOG4.

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Genoms des Rabies-Virus. Orientiert an einer Abbildung in [87], S. 1224.

2.1.3 Übertragungswege RNA-Viren, zu denen auch das RV als Erreger der Tollwut zählt, stellen das weltweit am stärksten verbreitete ZNS-Infektionen induzierende Pathogen dar; dazu zählen neben dem Rabies Virus das West-Nil-Virus, das Polio-Virus und das Japanische Enzephalitis-Virus [109].

Die Verbreitung der Tollwut konnte durch groß angelegte Impfkampagnen für Haus- und Wildtiere sowie die Vakzinierung von Menschen mit erhöhtem Infektionsrisiko (Veterinärmediziner, Forstarbeiter etc.) in der westlichen Welt weitgehend eingedämmt werden. Dennoch versterben immer noch schätzungsweise 55 000 Menschen jährlich infolge der Erkrankung [188]. Am dramatischsten ist die Situation in Entwicklungs- und Schwellenländern. Allein Indien zählt jährlich 30 000 menschliche Todesopfer. Dort gibt es zudem für Erkrankung und Tod durch RV-Infektion keine Meldepflicht, weshalb die Dunkelziffer auf ein Vielfaches der offiziellen Zahlen geschätzt wird [19].

Meist wird das RV durch den Biss eines infizierten Tieres auf den Menschen übertragen. Die im Speichel befindlichen Viren dringen in Nervenendigungen im Bereich der Bisswunde ein. Mittels retrogradem axonalem Transport gelangen die Viren ins ZNS, wo sie sich replizieren. Es wird angenommen, dass sie von dort orthograd in die Speicheldrüsen weiter transportiert werden und somit wieder im Speichel des infizierten Tieres bzw. Menschen nachgewiesen und weiter übertragen werden können [36]. Generell ist der Speichel RV-infizierter Tiere und Menschen infektiös, auch durch Schleimhautkontakt mit diesem ist eine Übertragung der Infektion möglich [189].

In einigen Asiatischen Ländern wie Vietnam, Südkorea, Thailand oder Indien ist es üblich, Hundefleisch zu essen [13]. Zwischen 2005 und 2007 häuften sich humane Tollwuterkrankungen in den Chinesischen Provinzen Guizhou, Guangxi und Hunan. Durch Gensequenzierungen konnte gezeigt werden, dass dieselben RVStämme bei Hunden vorkamen, die zum Verzehr in Restaurants bestimmt waren.

Insofern kann davon ausgegangen werden, dass auch der Verzehr infizierter Tiere einen Übertragungsweg der Tollwuterkrankung darstellt [167].

In den letzten Jahren wurde zudem mehrfach berichtet, dass Patienten Symptome der Tollwut entwickelten und verstarben, nachdem ihnen Organe transplantiert worden waren [91,191]. Dies konnte geschehen, weil die Symptome der Spender vor ihrem Tod missinterpretiert wurden und Spenderorgane nicht routinemäßig auf Rabies getestet werden – dies liegt zum einen in der Seltenheit des Auftretens der Erkrankung in Westeuropa begründet. Zum anderen ist die bisher verfügbare Diagnostik zu langwierig, um den engen Zeitraum zwischen Organentnahme und Transplantation einzuhalten [191].



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