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«DISSERTATION Präklinische Evaluation pflanzlicher Extrakte aus Helleborus niger und Viscum album L. sowie eines Gold(I)Phosphinkomplexes mit ...»

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Aus der Klinik für Pädiatrie m. S. Onkologie und Hämatologie

der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Präklinische Evaluation pflanzlicher Extrakte aus Helleborus

niger und Viscum album L. sowie eines Gold(I)Phosphinkomplexes mit funktionellem Naphthalimidliganden

bezüglich ihrer Apoptose- induzierenden Wirksamkeit und den

dabei zugrunde liegenden Mechanismen in vitro, ex vivo und in vivo.

zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin von Patrick Jesse aus Berlin Gutachter: 1. Prof. Dr. med. Dr. h. c. G. Henze

2. Prof. Dr. med. N. Graf

3. Priv.-Doz. Dr. rer. nat. T. Wieder Datum der Promotion: 03.09.2010 Inhaltsverzeichnis

Abstract

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung

1.1 Helleborus niger in der Begleittherapie onkologischer Erkrankungen

1.2 Mistellektine als zytostatisch aktive Substanzen in Viscum album L

1.3 Metallkomplexe in der Tumortherapie

1.4 Apoptose als Wirkmechanismus zytostatischer Substanzen

2 Zielstellung

3 Methodik

3.1 Verwendete Geräte

3.2 Verbrauchsmaterialien

3.3 Chemikalien und Reagenzien

3.4 Kommerzielle Kits und Antikörper

3.5 Verwendete Pflanzenextrakte und Wirkstoffe

3.5.1 Helleborus niger Extrakte

3.5.2 Extrakte aus Viscum album L

3.5.3 Gold(I)-Phosphinkomplex mit Naphthalimidliganden

3.6 Verwendete Zelllinien und primäre Zellen

3.7 Messung der LDH- Freisetzung

3.8 Proliferationsmessung

3.9 Annexin-V/Propidiumiodid- Doppelfärbung

3.10 Apoptosemessung mittels modifizierter Zellzyklusanalyse

3.11 Mitochondriale Membranpotentialanalyse mittels JC-1

3.12 Western Blot- Verfahren und Immundetektion

3.13 Datenauswertung und Statistik

4 Ergebnisse

4.1 Präklinische Evaluation von Helleborus niger Extrakt in vitro und ex vivo (Publikation 1)

4.1.1 Ausschluss eines unspezifischen Zelltodes und Inhibition der Zellproliferation.......16 4.1.2 Apoptoseinduktion

4.1.3 Aktivierung des intrinsischen Apoptoseweges

4.1.4 Synergistische Effekt mit Vincristin

4.1.5 Apoptoseinduktion in primären Patientenzellen

4.2 Molekulare Mechanismen der durch Mistelextrakte induzierten Apoptose in einem ALL- Modell in vitro und in vivo (Publikation 2)

4.2.1 In vitro- Ergebnisse

4.2.2 In vivo- Ergebnisse

4.3 Antiangiogenetische und antiproliferative Effekte eines Gold (I)-Phosphinkomplexes mit funktionellem Naphthalimid-Liganden (Publikation 3)

4.3.1 Antiproliferative Effekte und Bioverteilung

4.3.2 Inhibition der Thioredoxinreduktase und Apoptoseinduktion

4.3.3 Hemmung der Angiogenese in einem Zebrafischmodell

5 Diskussion

6 Literaturverzeichnis

7 Anteilserklärung

8 Verwendete Publikationen

9 Lebenslauf

10 Komplette Publikationsliste

11 Selbstständigkeitserklärung

12 Danksagung

Abstract Onkologische Erkrankungen gehören nach Herz- Kreislauferkrankungen zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Die Entwicklung neuer Wirkstoffe für die Behandlung dieser Erkrankungen ist somit von Interesse. Hierbei bietet zum einen die Suche nach neuen zytostatisch wirksamen Substanzen in Pflanzenextrakten einen viel versprechenden Ansatzpunkt, zum anderen bildet die Weiterentwicklung schon bekannter Wirkstoffe durch Verbindung mit zusätzlich funktionellen Gruppen ein interessantes Forschungsfeld. In der vorliegenden Arbeit wurden Pflanzenextrakte aus Helleborus niger und Viscum album L. sowie ein neu synthetisierter Gold(I)Phosphinkomplex mit Naphthalimidliganden auf ihre biologische Aktivität in vitro, ex vivo und in vivo untersucht.

Bei der Untersuchung der Extrakte aus Helleborus niger konnten erste präklinische Daten zur in vitro- Wirksamkeit auf einer Reihe von Zelllinien gewonnen werden. Eine Inkubation mit Helleborus niger Extrakt inhibiert die Proliferation von Tumorzellen und induziert spezifisch Apoptose in BJAB, NALM-6, SUP-B15, JURKAT und REH Zellen. Die Apoptose erfolgt über den intrinsischen, mitochondrialen Signalweg mit konsekutiver Prozessierung der Caspase-3 und ist nicht vollständig durch Überexpression des antiapoptotischen Bcl-2 Proteins blockierbar. Eine Apoptoseinduktion konnte auch in primären Patientenzellen von Kindern mit neu diagnostizierter ALL und AML sowie dem Rezidiv einer AML gefunden werden. In der zweiten Publikation wurde erstmalig die Wirksamkeit von Viscum album L. Extrakten in einem akuten lymphoblastischen Leukämie Modell in vitro und in vivo evaluiert und die Rolle des MistellektinIII an der zytotoxischen Wirkung genauer untersucht. Hierzu wurden ein ML-III reiches (MT-P) und ein ML-III armes (MT-P) Extrakt verwendet. In vitro kommt es zu einer dosisabhängigen Proliferationsinhibition und Apoptoseinduktion durch antimitochondriale Effekte in NALM-6 Zellen, die eng mit dem ML-III Gehalt der verschiedenen Viscum album L. Extrakte korrelieren.

In vivo zeigte sich jedoch eine höhere antileukämische Potenz des ML-III armen MT-A, so dass der antileukämische Effekt der verwendeten Extrakte nicht allein auf ihren absoluten ML-III Gehalt zurückgeführt werden kann.





In der dritten publizierten Arbeit konnte gezeigt werden, wie die zytotoxische Potenz von Gold(I)Phosphinverbindungen durch die Kopplung mit einem funktionellen Liganden verbessert werden kann. Der neu synthetisierte Gold(I)-Phosphinkomplex mit Naphthalimidliganden weist sowohl antiproliferative als auch antiangiogene Eigenschaften auf und verursacht eine Apoptoseinduktion durch antimitochondriale Effekte. Der Naphthalimidligand ist hierbei für eine höhere Goldakkumulation im Zellkern sowie die antiangiogenen Effekte des Komplexes verantwortlich.

Die Naphthalimidstruktur konnte somit als beachtenswerter Ligand für die Gewinnung neuer Komplexe mit erhöhter zytotoxischer Effektivität identifiziert werden.

Abkürzungsverzeichnis

–  –  –

1 Einleitung Die Suche nach neuen Medikamenten und Wirkstoffen für die Behandlung onkologischer Erkrankungen bildet einen großen pharmazeutischen Forschungsschwerpunkt. Trotz erheblicher Anstrengungen die Therapieerfolge maligner Erkrankungen zu verbessern, ist die Anzahl effizienter Medikamente und Wirkstoffe weiterhin limitiert und die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe und Behandlungsalternativen ist somit notwendig. Hierbei bietet zum einen die Suche nach neuen zytostatisch wirksamen Substanzen in Pflanzenextrakten einen viel versprechenden und reichhaltigen Ansatzpunkt, zum anderen bildet die Weiterentwicklung schon bekannter Wirkstoffe durch Verbindung mit zusätzlich funktionellen Gruppen oder Substanzen, welche die zytostatische Wirkung potenzieren, ein interessantes Forschungsfeld. Auch die Kombination zweier Wirkstoffe in einem Medikament kann nicht nur additive, sondern zudem synergistische Effekte hervorrufen, so dass die zytostatische Potenz des Medikamentes um ein Vielfaches gesteigert werden kann.

Zytostatisch aktive Substanzen aus Naturstoffen und speziell Pflanzen, z.B. der Vinkaalkaloide aus Catharanthus roseus oder Taxol aus Taxus brevifolia, werden in der Medizin und besonders in der Onkologie häufig als hochwirksame Pharmaka eingesetzt oder sind Vorbild synthetischer Wirkstoffe.1 Diese wurden aus pflanzlichen Extrakten isoliert, bei denen man eine Wirkung auf maligne Zellen gefunden hat, ohne zunächst die für diese Wirkung verantwortlichen Stoffe zu kennen. Die Isolierung dieser Stoffe und chemische Synthetisierung führte schließlich zu den heute sehr erfolgreich in der Therapie maligner Erkrankungen eingesetzten Wirkstoffen. Im Bereich alternativer Krebstherapien ist die Verwendung pflanzlicher Extrakte auch heutzutage noch weit verbreitet. Häufig liegen zu den verwendeten Extrakten keine präklinischen Daten oder klinisch- evaluierte Studien vor und die Verwendung beruht auf „erfahrungsheilkundlicher“ Basis.

Die zugrunde liegenden Mechanismen der Wirksamkeit sind meist nur – wenn überhaupt rudimentär erforscht. Der langjährige Einsatz dieser Extrakte macht es jedoch dringend notwendig, die Wirksamkeiten und deren zugrunde liegenden Mechanismen genauer zu evaluieren und die verantwortlichen Inhaltsstoffe zu identifizieren.

1.1 Helleborus niger in der Begleittherapie onkologischer Erkrankungen Helleborus niger, die schwarze Nieswurz oder Christrose, wird in der anthroposophischerweiterten Medizin in der Begleittherapie onkologischer Erkrankungen eingesetzt. Zu den Indikationen zählen Hirntumore bei Kindern, Prostatakarzinome, sowie Leukämien und Lymphome. Helleborus niger gehört zur Familie der Hahnenfußgewächse (Ranunculaceae).

Helleborus niger zeichnet sich durch ein ausgeprägtes, schwarzbraunes Rhizom und einen kräftigen Wurzelstock aus. Die dunkelgrünen Blätter fächern sich fußförmig auf und am unverzweigten Blütenstängel befinden sich die weißen Blütenblätter. Die Pflanze erreicht eine Höhe zwischen 15 und 30 cm. Die Blütezeit dauert von Dezember bis April.2,3 Zu den bisher aus Helleborus niger isolierten Bestandteilen gehören Saponine, Flavonoide, Bufadienolide und βEcdyson. 4-6 Obwohl Helleborus niger in der anthroposophisch- erweiterten Begleitbehandlung onkologischer Erkrankungen eingesetzt wird, liegen bislang keine präklinischen Daten zur Wirksamkeit des Extraktes in vitro und in vivo vor.

1.2 Mistellektine als zytostatisch aktive Substanzen in Viscum album L.

Ein zweites Forschungsfeld im Bereich der pflanzlichen Wirkstoffe bilden Extrakte aus Viscum album L. Im Gegensatz zur Verwendung von Helleborus niger liegen bereits zahlreiche Untersuchungen zum Einsatz von Mistelextrakten bei onkologischen Erkrankungen vor, die Effektivität ihrer Anwendung wird jedoch weiterhin kontrovers diskutiert.7-10 Zu den bekannten Inhaltsstoffen der Mistelextrakte gehören Mistellektine, Viscotoxine, Polysaccharide und Triterpene, deren Zusammensetzung je nach Wirtsbaum stark variiert.11-15 Vor allem die Mistellektine sind in den letzten Jahren in den Mittelpunkt der Forschung getreten, da sie zu einem großen Teil für die zytotoxische Wirkung von Mistelextrakten verantwortlich zu sein scheinen.11,16 Insgesamt sind 4 Arten der Mistellektine - ML-I, -II, -III und das chitinbindende Lektin - bekannt. Die Mistellektine bestehen aus einer A- und B- Kette.17 Die A-Kette bindet an die 60S ribosomale Untereinheit und führt zu einer Inhibition der ribosomalen Proteinbiosynthese.18,19 Die B-Kette bindet an Galaktose- und Neolaktogangliosidreste der Zelloberfläche und vermittelt somit den Kontakt zur Zielzelle.20 Durch Inhibition der ribosomalen Proteinbiosynthese kommt es zur Apoptoseinduktion und zum Untergang der Zelle.21 Die A-Kette der Mistellektine ist in allen drei Mistellektinen sehr ähnlich,22 wohingegen die B-Kette lektinspezifisch ist.23 Die Mistellektine haben unterschiedliche zytotoxisch funktionelle Eigenschaften. Bislang ist jedoch der Anteil von ML-III an der durch Mistelextrakte hervorgerufenen zytotoxischen Wirkung nicht genau untersucht. Auch gibt es noch keine Daten zur in vitro- und in vivo- Wirksamkeit von Mistelextrakten in einem Leukämiemodell.

1.3 Metallkomplexe in der Tumortherapie Ein weiteres experimentelles Forschungsfeld für die zukünftige Behandlung von Tumorerkrankungen bilden Metallkomplexe. Der Erfolg der derzeit in der Behandlung unterschiedlicher Tumorentitäten eingesetzten Platinverbindungen wie Cis- oder Carboplatin zeigt das Potential von Metallkomplexen in der Tumortherapie auf.24 Die zahlreichen und teilweise schweren Nebenwirkungen, sowie die Resistenzentwicklung gegenüber diesen Verbindungen limitieren deren Einsatz jedoch häufig.25 Neben Platinverbindungen bieten Goldverbindungen einen interessanten Ansatzpunkt.26 Erste Untersuchungen zeigen, dass die antiproliferativen Effekte von Goldkomplexen am ehesten durch das Goldion selbst hervorgerufen werden und auf kovalenten Interaktionen mit Disulfidreduktasen wie der Thioredoxinreduktase beruhen.27 Die Aufnahme der Goldkomplexe in ihre Zielkompartimente erfolgt über funktionelle Liganden. Sie sind für die Verteilung und die kinetischen Eigenschaften der Goldkomplexe verantwortlich. Die zytotoxischen Eigenschaften von Goldkomplexen könnten somit durch die Verbindung mit zusätzlich antiproliferativen Liganden potenziert werden. Eine interessante Gruppe von Liganden bilden hierbei die Naphthalimide.28 Die chemische Synthese und erste biologische Evaluation eines solchen Gold(I)-Phosphinkomplexes mit Naphthalimidliganden wurden in der dritten veröffentlichten Arbeit untersucht.

1.4 Apoptose als Wirkmechanismus zytostatischer Substanzen Die meisten zytostatisch aktiven Stoffe wirken über eine Induktion der Apoptose. Als Apoptose wird der „gerichtete“ oder „programmierte“ Zelltod bezeichnet. Eine entscheidende Rolle im Ablauf der Apoptosekaskade spielen die Cysteinylaspartasen, die sog. Caspasen.29 Sie werden in Initiator- und Effektorcaspasen unterteilt. Zu den Initiatorcaspasen zählen die Caspasen-8, -9 und

-2, zu den Effektorcaspasen die Caspasen-3, -6 und -7.30,31 Ihre Aktivierung erfolgt mittels proteolytischer Spaltung durch die übergeordneten Initiatorcaspasen. Die Effektorcaspasen leiten die endgültige Exekution des apoptotischen Zelltods ein und führen durch Spaltung verschiedener Proteine u.a. zum Anhalten der Zellteilung, Inaktivierung von Reparaturmechanismen, Auflösung des Zytoskeletts und der Kernmembran.32 Die Apoptose kann auf drei Hauptsignalwegen erfolgen, die entweder über Todesrezeptoren der Zellmembran, Aktivierung und Freisetzung proapoptotischer Faktoren aus dem Mitochondrium oder das Endoplasmatische Retikulum vermittelt werden.33 Der extrinsische Apoptoseweg führt über spezifische Ligandenbindung an Oberflächenrezeptoren wie CD95 oder TRAIL der Zielzellen zu deren Konformitätsänderung und Internalisierung, woraufhin auf der zytosolischen Seite über eine sog. Todesdomäne Adapterproteine wie TRADD oder FADD rekrutiert werden.34 Diese Adapterproteine bilden mit der Initiatorcaspase-8 den DISC-Komplex, in dem Caspase-8 Monomere rekrutiert und durch Dimerisierung aktiviert werden.32 Aktive Caspase-8 kann dann Effektorcaspasen, wie Caspase-3, -6 und -7 aktivieren.



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