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«Dissertation Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) an der Fakultät für Biologie der Ludwig-Maximilians ...»

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Functional characterisation and Mutational analysis of

a bacterial dynamin-like protein, DynA

by Prachi Sawant

Dissertation

Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

an der Fakultät für Biologie der

Ludwig-Maximilians Universität München

May, 2015

Functional characterisation and Mutational analysis of

a bacterial dynamin-like protein, DynA

PhD thesis by Prachi Dilip Sawant

Supervised by Professor Dr. Marc Bramkamp

Ludwig-Maximilians Universität

Biology, Department I Eidesstattliche Erklärung Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst habe, keine als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt wurden und alle Zitate kenntlich gemacht sind. Des Weiteren versichere ich, nicht anderweitig ohne Erfolg versucht zu haben, eine Dissertation einzureichen oder mich einer Doktorprüfung zu unterziehen. Die vorliegende Dissertation liegt außerdem keiner anderen Prüfungskommission vor.

I hereby confirm that I have written the accompanying thesis by myself, without contributions from any sources other than those cited in the text. This also applies to all graphics, drawings and images included in this thesis. Moreover, I declare that I have not submitted or defended a dissertation previously without success. This thesis has not been presented to any other examining board.

Ort, Datum Martinsried,

Gutachter:

1. Prof. Dr. Marc Bramkamp

2. Prof. Dr. Thorsten Mascher Datum der Abgabe: 27.05.2015 Datum der Prüfung: 03.07.2015 Prachi Sawant, PhD thesis, Department I, Microbiology, LMU Index 1

Abstract

5 Zusammenfassung 7 Abbreviations 9 Introduction 12 1 Environmental stress in bacteria 13

1.1 Antibiotic induced cell-envelope stress 13

1.2 Phage stress 17 2 Bacterial responses to environmental stress 18

2.1 Phage Shock Protein (PSP) response against envelope stress 19

2.2 Membrane remodelling

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Abstract Membrane remodeling is a dynamic process that occurs in bacterial cells to facilitate substrate transport and to provide protection to bacteria during environmental stress. In eukaryotic cells, membrane remodeling is carried out by dynamin-like proteins (DLPs). These proteins are involved in diverse membrane-associated functions such as cargo transport via vesicles, cytokinesis, division of cell organelles and resistance to pathogens. DLPs are also conserved in bacterial species; however, their function is still not clearly understood. The genome of B. subtilis contains a gene dynA (ypbR), which encodes a large DLP (136 KDa), DynA, that can tether membranes and induce membrane fusion in vitro. Deletion of dynA in B.

subtilis strain 168 fails to produce any observable growth phenotype under standard laboratory conditions. B. subtilis is a soil bacterium and prey to several environmental stress factors to which laboratory strains are normally not exposed. Hence, it was conceivable that DynA might be required when bacteria are exposed to stress. To address this hypothesis, the behavior of DynA was examined under conditions causing membrane-stress, such as exposure to antibiotics and phage infection. A strain lacking dynA showed impaired growth in the presence of sublethal amounts of antibiotics that target the cell membrane and was more sensitive to phage infection compared to wild-type strains. Time-lapse microscopy and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) experiments showed that ∆dynA cells have compromised membrane remodeling compared to wild-type strain. In conclusion, all results propose DynA to play a role in protecting the cell membrane under stress conditions. Also, for the first time, it is shown that a bacterial DLP contributes to innate immunity of bacteria.

DynA not only has a unique membrane protection function but also distinctive structural features. A single DynA polypeptide contains two dynamin-like subunits, each consisting of a GTPase domain and a dynamin-like stalk region. Both subunits, D1 and D2, share strong intra-molecular cooperativity to facilitate GTPase activity. Here, a combination of mutational analysis and subsequent in vivo and in vitro investigation was applied to further characterise

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elucidated that DynA dimerisation requires C-terminal amino acids 591-620. In addition, in vivo localisation, in vitro lipid-binding and GTPase analysis revealed arginine at position 512 of DynA to be a key regulator of GTP hydrolysis as well as lipid-binding. Furthermore, in vivo localisation and bacterial two-hybrid experiments were employed to confirm interaction of DynA with putative interaction partners (YneK, YwpG and YmdA). YneK was found to interact with D1 and YwpG with D1 and D2 individually, whereas YmdA required a full-length DynA (D1+D2) for interaction. Taken together, the results presented here greatly expand on current knowledge regarding functional, biochemical and structural properties of a bacterial dynamin-like protein (BDLP). This thesis not only demonstrates the preserved membraneremodeling function of DLPs in bacteria but also explain their conservation from bacteria to higher-organisms.

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Zusammenfassung Membranremodellierung ist ein dynamischer Prozess, der bakteriellen Zellen den Im- und Export von Substraten über die Membran ermöglicht und für den Erhalt der Zellintegrität unter Umweltstressbedingungen sorgt. Die Membranremodellierungseigenschaften Dynamin-ähnlicher Proteine (dynamin-like proteins [DLPs]) wurden bereits intensiv in eukaryotischen Zellen untersucht. Proteine aus dieser Familie sind dort in diverse membranassoziierte Prozesse involviert, wie z.B. dem vesikulärem Cargotransport, der Zytokinese, der Teilung von Zellorgenellen und bei der Resistenz gegenüber Pathogenen.





Obwohl DLPs in vielen Bakterien konserviert vorliegen, ist noch nicht geklärt, welche Funktion sie in diesen Organismen ausüben. Das im Genom von Bacillus subtilis kodierte DynA ist ein bakterielles DLP mit einem Molekulargewicht von 136 kDa. In vitro Studien haben gezeigt, dass DynA Membranen zusammenführen und fusionieren kann. Die Deletion von dynA im B. subtilis Stamm 168 führte allerdings nicht zu einem Wachstumsdefekt unter standardisierten Kultivierungsbedingungen. In seiner natürlichen Umgebung im Erdboden ist

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Laborbedingungen keine Rolle spielen. Es wurde daher die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass DynA hauptsächlich unter besonderen Stressbedingungen von der Zelle benötigt wird.

Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde das Verhalten von DynA unter erhöhtem Membranstress untersucht. Stämme ohne DynA zeigten im Vergleich zum Wildtypen ein beeinträchtigtes Wachstum in Anwesenheit von Antibiotika und eine höhere Sensitivität gegenüber Infektion durch Phagen. Zusätzlich konnte durch Zeitraffer-Mikroskopie und

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Membranremodellierungsaktivität von ∆dynA im Vergleich zum Wildtypen festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DynA eine Funktion zum Schutz der Zellmembran von B. subtilis unter Stressbedingungen ausübt. Zusätzlich konnte damit zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein bakterielles DLP zu der angeborenen Immunantwort von

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Neben seiner außergewöhnlichen Funktion zum Schutz der Zellmembran besitzt DynA auch spezielle strukturelle Eigenschaften: ein einziges DynA Polypeptid beinhaltet zwei Dynaminähnliche Untereinheiten, die jeweils wiederum aus einer GTPase und einer „dynamin-like stalk-region“ Region zusammengesetzt sind. Die beiden D1 und D2 genannten Untereinheiten zeigen beide jeweils eine starke intramolekulare Kooperativität zur Stimulierung ihrer GTPase Aktivität. Durch das Einführen von gezielten genetischen Veränderungen in dynA und der anschließenden funktionellen in vivo und in vitro Charakterisierung wurden in dieser Arbeit der Einfluss einer veränderten Aminosäuresequenz auf die biochemischen Eigenschaften sowie die strukturelle Assemblierung des Proteins untersucht. Studien mittels Größenausschlusschromatographie zeigten, dass die C-terminalen Aminosäuren 591-620 essentiell für die Fähigkeit zu Dimerisierungvon DynA sind. Zusätzliche in vivo Lokalisationsstudien, in vitro Lipidbindestudien und GTPase Aktivitätsuntersuchungen zeigten, dass Arginin an Stelle 512 des Proteins eine Schlüsselrolle bei der Regulation der

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Lokalisationsstudien und bakterielle Zwei-Hybrid-Experimente durchgeführt um die Interaktion von DynA mit seinen potentiellen Interaktionspartnern YneK, YwpG und YmdA zu bestätigen und weiter zu untersuchen. Während YneK nur mit der D1 Untereinheit und YwpG individuell mit beiden Untereinheiten interagierte, benötigt YmdA das komplette DynA Protein mit D1 und D2 Untereinheit zur Interaktion. Zusammenfassend betrachtet konnten durch diese Ergebnisse der derzeitige Wissensstand über die funktionellen, biochemischen und strukturellen Eigenschaften bakterieller DLPs deutlich erweitert werden. Diese Arbeit zeigt nicht nur, dass DLPs ebenfalls in Bakterien eine Membranremodellierungsfunktion ausüben können, sondern liefert damit auch abschließend eine Erklärung für die Konservierung der DLPs von Bakterien bis hin zu höheren Organismen.

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GMP-PNP 5'-Guanylyl imidodiphosphate GTP Guanosine triphosphate His Histidine HR Heptad repeat LPS Lipopolysaccharide LTA Lipoteichoic acid mDNA Mitochondrial Deoxyribonucleicacid MDR Multi-drug resistant Mdv1 Mitochondrial division protein 1 Mfn1/2 Mitofusin 1/2 Mgm1 Mitochondrial genome maintenance protein 1 MPF Mass-peptide fingerprinting mRNA Messenger Ribonucleic acid MW Molecular weight NAG N-acetylglucosamine NAM N-acetylmuramic acid NP Nucleoprotein OM Outer membrane OPA1 Optic atrophy protein 1 PBP Penicillin-binding protein PC Phosphatidylcholine PDV1/2 Plastid division protein 1/2 PE Phosphatidylethanolamine Pex10 Peroxisome biogenesis factor 10 PG Phosphatidylglycerol PH Pleckstrin homology PL Phospholipid PMF Proton motive force PML Promyelocytic leukemic protein PRD Proline-rich domain PSP Phage shock protein QPA Quantitative plaque assay RNA Ribonucleic acid ROS Reactive oxygen species RR Response regulator SDM Site-directed mutagenesis

Prachi Sawant, PhD thesis, Department I, Microbiology, LMU

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis SLS Synthetic lethal screen SNARE SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) REceptor SNX9 Sorting nexin-9 SUMO Small ubiquitin-related modifier TA Teichoic acid TCS Two-component system TM Transmembrane TP Terminal protein UDP Uridine diphosphate Vps1 Vacuolar protein sorting-associated protein 1

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Introduction The endosymbiotic theory, articulated by Konstantin Mereschkowski in 1910, claims eukaryotic cells to have originated from symbiotic associations between single-celled organisms. Best examples of such associations are chloroplasts that are known to have a cyanobacterial origin and mitochondria, which seem to have developed from heterotrophic proteobacteria (Kutschera and Niklas 2005). Eukaryotic cells are larger than bacteria and complicated in terms of structure and function. Hence, it is conceivable that some nonessential genes from bacteria that were passed on to eukaryotes might have evolved an essential function during evolution. A classic example of such an evolutionary conservation is the dynamin group of proteins (conserved in chloroplasts as well as mitochondria), preserved across prokaryotic and eukaryotic species. While known to be essential in eukaryotic cells, prokaryotic dynamins remain poorly characterized. Eukaryotic dynamins and dynamin-like proteins (DLPs) are lipophilic GTPases with conserved membraneremodelling features. Membrane remodelling is required by bacteria to counteract changes in the external environment (i.e., temperature, pH, osmolality, ions, solute, etc.) for survival.

Several bacteria encode DLPs, including the Gram-positive Bacillus subtilis which is well known for its diverse survival strategies under external stress. This bacterium lives in soil habitats and are frequently exposed to environmental stress and starvation. B. subtilis can easily adapt to changes in the external environment by activating several stress-response pathways, the most common being stress-resistant endospore formation and starvationinduced biofilm generation. B. subtilis encodes a DLP called DynA, which shows membrane remodelling characteristics in vitro but was found to be non-essential for bacterial growth.

However, DLPs such as Mx proteins and IniA have demonstrated their essentiality under stress conditions that were induced by viruses and antibiotics, respectively (discussed below). This PhD project has therefore focused on unravelling the importance of DynA in B.

subtilis, upon exposure to environmental stress.

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1. Environmental stress in bacteria Environmental stress is a condition, which refers to the adverse effects caused by an external factor on the physical well-being of a bacterial cell. These factors include extremes of pH, temperature, osmolality, nutrient supply and presence of antimicrobial compounds. Two of the most common environmental factors that induce stress in bacterial cells are antibiotics (Kohanski et al 2010) and bacteriophages (Samson and Moineau 2013), their portal of entry being the host cell membrane.

1.1 Antibiotic induced cell-envelope stress Exposure to antibiotics can adversely affect several cellular processes that ultimately lead to bacteriostaticity or bacterial lysis, whereas exposure to sub-lethal concentrations can induce cross-protection leading to development of antibiotic resistant bacteria. The cell envelope is the first accessible target as well as the first line of defense against antimicrobial compounds.



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