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«Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Eva ...»

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Neue Ansätze zur Entwicklung von

Alternativmethoden zur Prüfung auf chronische

Nierentoxizität

Dissertation

zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Eva Katharina Rached

aus Würzburg

Würzburg 2009

Eingereicht am:

Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender: Prof. Dr. Th. Dandekar

1. Gutachter: Prof. Dr. W. Dekant

2. Gutachter: Prof. Dr. Th. Brand

Tag des Promotionskolloquiums:

Doktorurkunde ausgehändigt am:

Erklärung Gemäß § 4 Abs. 3 S. 3, 5 und 8 der Promotionsordnung der Fakultät für Biologie der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg.

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation „Neue Ansätze zur Entwicklung von Alternativmethoden zur Prüfung auf chronische Nierentoxizität“ selbständig angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation weder in gleicher noch in anderer Form bereits in einem Prüfungsverfahren vorgelegen hat.

Ich habe früher, außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten Graden, keine weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.

______________

Eva Rached Danksagung Ich möchte mich bei all diesen Personen ganz herzlich bedanken, die zum Gelingen

dieser Arbeit von März 2005 bis März 2008 beigetragen haben:

PD Dr. Angela Mally für die ständige Betreuung der Doktorarbeit und ihre Hilfsbereitschaft, das mir entgegengebrachte Vertrauen, und die Möglichkeit, an verschiedenen Tagungen teilzunehmen.

Prof. Dr. Wolfgang Dekant für die Ermöglichung der Doktorarbeit und die Erstellung des Erstgutachtens.

Prof. Dr. Thomas Brand für die Übernahme des Zweitgutachtens und seine Bereitschaft, Mitglied meiner Prüfungskommission zu sein.

Prof. Dr. Georg Krohne und dem gesamten Team in der Elektronenmikroskopie für Geduld, Hilfsbereitschaft und ein sehr angenehmes Arbeitsumfeld.

RCC Ltd. (jetzt Harlan Laboratories Ltd.) für die Finanzierung der Arbeit und insbesondere natürlich Dr. Kai Blumbach, Dr. Klaus Weber und Regina Draheim für ihre Mithilfe beim Tierversuch und ein stets offenes Ohr für Fragen.

Dr. Gordon Hard für die histopathologische Beurteilung.

Dr. Sibel Özden für die Durchführung der LC/MS-MS-Versuche.

Dr. Ulrich Steger für seine Mithilfe beim Pumpeneinbau.

Elisabeth Rüb-Spiegel, Michaela Bekteshi und Carolin Kröcher für ihre geduldige Mitwirkung beim Tierversuch.

Ursula Tatsch für ihre tatkräftige Mithilfe bei allem, was so anstand, sowie für ihre stets fröhliche Gelassenheit.

Allen Mitarbeitern von der „Toxi“ für eine gute Zusammenarbeit und die freundliche Arbeitsatmosphäre.

Inhaltsverzeichnis

–  –  –

1.2 Zielorgan Niere

1.2.1 Struktur und Funktionen der Niere

1.2.2 Strukturelle und physiologische Unterschiede zwischen verschiedenen Typen von proximalen Tubulusepithelzellen

1.2.3 Ursachen und Folgen toxischer Effekte auf das proximale Tubulusepithel.........8

1.3 Prüfung auf Nephrotoxizität: Konventionelle Testverfahren und die Entwicklung von Alternativmethoden

1.4 Neue Methoden zum frühzeitigen Nachweis von Nierentoxizität und

-kanzerogenität

1.4.1 Entwicklung von neuen Biomarkern zum Nachweis von Nierenschädigung.....11 1.4.1.1 Definition und Anwendungen von Biomarkern

1.4.1.2 Traditionelle Biomarker zur Bestimmung einer gestörten Nierenfunktion

1.4.1.3 Entwicklung neuer Biomarker zur frühen Diagnose von Nierenschäden

1.4.1.4 Neue Biomarker für akute Nierenschädigung

1.4.2 Identifizierung von Nierenkanzerogenen

1.4.2.1 Chemikalien-induzierte Kanzerogenese

1.4.2.2 Konventionelle und neue Teststrategien zur Prüfung auf kanzerogene Eigenschaften

1.4.2.3 Bekannte Mechanismen von nicht-gentoxischen Nierenkanzerogenen

1.5 In vitro-Alternativen zur Prüfung auf Nephrotoxizität

1.5.1 Vorteile und Grenzen von in vitro-Systemen

1.5.2 Neue Ansätze zur in vitro-Prüfung auf Toxizität nach wiederholter Exposition – NOEC vs. NOAEL

1.5.3 In vitro-Modellsysteme zur Prüfung auf Nierentoxizität

1.5.4 Ansatzpunkte für die Entwicklung von zellkulturbasierten Testsystemen zur Prüfung auf chronische Nephrotoxizität

1.6 Nephrotoxische Modellsubstanzen

1.6.1 Ochratoxin A (OTA)

1.6.2 Cadmium

Inhaltsverzeichnis II

1.6.3 Cisplatin

2 Material und Methoden 42

2.1 Material

2.1.1 Technische Geräte

2.1.2 Verbrauchsmaterialien

2.1.3 Chemikalien

2.1.4 Kits und Mastermix-Lösungen

2.1.5 Puffer und Lösungen

2.1.6 Antikörper

2.1.7 Oligonukleotide für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

2.1.8 DNA- und Proteingrößenstandards

2.1.9 Verwendete Computerprogramme

2.2 Methoden

2.2.1 Zellbiologische Methoden

2.2.1.1 Desinfektion und Sterilisation

2.2.1.2 Normal Rat Kidney-Zellen (NRK-52E)





2.2.1.3 Kultivierung von NRK-52E-Zellen

2.2.1.4 Kryokonservierung und Auftauen der Zellen

2.2.1.5 Behandlung der Zellen mit verschiedenen Nierentoxinen

2.2.1.6 Bestimmung der Zytotoxizität mit dem MTT-Assay

2.2.2 Tierversuch

2.2.2.1 Fischer-Ratten (F344/N)

2.2.2.2 Haltung von F344/N-Ratten

2.2.2.3 Behandlung mit Ochratoxin A

2.2.2.4 Bestimmung der Zellproliferation mit 5’-Bromdesoxyuridin (BrdU)..........58 2.2.2.5 Entnahme von Urinproben

2.2.2.6 Blutentnahme

2.2.2.7 Tötung der Tiere, Organentnahme und Fixierung

2.2.2.8 Histopathologie

2.2.2.9 Klinische Chemie, Urinanalyse und Hämatologie

2.2.2.10 Bestimmung der Ochratoxin A-Konzentration in Plasma und Gewebe

2.2.2.11 Elektronenmikroskopie

2.2.3 Molekularbiologische Methoden

2.2.3.1 Arbeiten mit RNA

2.2.3.2 RNA-Isolierung

2.2.3.3 Quantifizierung der RNA

2.2.3.4 RNA-Elektrophorese

2.2.3.5 Synthese von komplementärer DNA (complementary DNA, cDNA)........67 Inhaltsverzeichnis III 2.2.3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

2.2.3.7 Polyacrylamid-Gelelektrophorese von DNA

2.2.4 Proteinbiochemische Methoden

2.2.4.1 Proteinisolierung

2.2.4.2 Proteingehaltbestimmung mit dem DC-Assay®

2.2.4.3 Auftrennung von Proteinen über SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE)

2.2.4.4 Western Blot

2.2.4.5 Immunhistochemische Detektion von Proteinen im Nierengewebe.........83 2.2.4.6 Immunfluoreszenzfärbung von Vimentin in NRK-52E-Zellen

3 Ergebnisse 88 3.1 90 Tage-Toxizitätstudie (oral, Schlundsonde) mit Ochratoxin A in männlichen F344/N-Ratten

3.1.1 Ochratoxin A-Konzentration in Plasma, Niere und Leber

3.1.2 Traditionelle Endpunkte für Toxizität

3.1.2.1 Klinische Symptome

3.1.2.2 Futter- und Wasseraufnahme

3.1.2.3 Körpergewicht

3.1.2.4 Organgewichte

3.1.2.5 Makroskopische Befunde

3.1.2.6 Histopathologie

3.1.2.7 Ultrastrukturelle Veränderungen in Nierenzellen

3.1.2.8 Klinische Chemie und Urinanalyse

3.1.2.9 Hämatologie

3.1.2.10 Zusammenfassung

3.1.3 Ochratoxin A-abhängige Effekte auf die Proliferation von Zellen in Niere und Leber

3.1.4 Expression von neuen Biomarkern für Nephrotoxizität

3.1.4.1 Expression von Markergenen im Nierengewebe Ochratoxin Abehandelter Ratten

3.1.4.2 Immunhistochemische Lokalisation von Markerproteinen im Nierengewebe

3.1.4.3 Exkretion von Markerproteinen in den Urin

3.1.4.4 Zusammenfassung

3.2 In vitro-Studien in NRK-52E-Zellen

3.2.1 Zytotoxität nach Behandlung mit verschiedenen Nephrotoxinen

3.2.2 Veränderungen der Gen- und Proteinexpression neuer Biomarker für Nephrotoxizität in NRK-Zellen nach Behandlung mit Nephrotoxinen..............132 3.2.3 Zusammenfassung

–  –  –

4.1.1 Veränderungen von Histopathologie und Zellproliferation in der Niere sind frühe Marker für die nierenschädigenden und kanzerogenen Eigenschaften von OTA

4.1.2 Bewertung der Sensitivität neuer Biomarker zum Nachweis chronischer Nephrotoxizität

4.1.3 Aspekte zur Risikobewertung von OTA

4.1.4 Neue Aspekte zum molekularen Wirkungsmechanismus von OTA................156 4.1.5 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen

4.2 Bewertung neuer in vivo-Biomarker für Nephrotoxizität in NRK-52EZellen als in vitro-Testsystem

–  –  –

9.2 Verzeichnis der Abkürzungen und Einheiten

9.3 Lebenslauf

9.4 Publikationen und Konferenzbeiträge

1 Einleitung

1.1 Ursachen und Folgen von Nierentoxizität Die Niere stellt eines der Hauptzielorgane für toxische Substanzen dar (Hart und Kinter 2005; Pfaller und Gstraunthaler 1998). Zahlreiche Pharmaka und Chemikalien aus Umwelt oder Industrie, z.B. Schwermetalle wie Cadmium, verschiedene Schimmelpilzgifte oder organische Lösungsmittel, besitzen nierenschädigende Eigenschaften, und es ist bekannt, dass die Exposition mit solchen Substanzen ein Risikofaktor für die Entstehung von Niereninsuffizienz sowie von Nierenkrebs ist (Franchini et al., 2005; Il'yasova und Schwartz 2005; Perazella 2005; Pfaller und Gstraunthaler 1998; Vaidya et al., 2008; Vassalotti et al., 2007).

Ursache für die hohe Anfälligkeit dieses Organs ist zum einen die hohe Durchblutungsrate der Niere (ca. 25% des Herzminutenvolumens), wodurch sie im Vergleich zu anderen Organen besonders gegenüber Fremdstoffen aus dem Blut exponiert wird. Zudem kann die Menge eines Stoffes durch Konzentrationsvorgänge in der Niere im Verhältnis zum systemischen Kreislauf stark erhöht werden und dabei toxische Spiegel erreichen. Daneben besitzt die Niere zahlreiche Transportmechanismen, durch die es zu einer Wiederaufnahme von Substanzen aus dem Primärharn und zu intrazellulärer Akkumulation kommen kann. Schließlich können Xenobiotika (z.B. Arzneimittel oder Naturstoffe) in der Niere durch fremdstoffmetabolisierende Enzyme verstoffwechselt werden, wobei toxische Intermediate entstehen können (Hart und Kinter 2005).

Die Früherkennung von toxischen Wirkungen auf die Niere ist sehr schwierig, da die Niere zum einen eine enorme funktionelle Reservekapazität besitzt, sodass die grundlegenden Funktionen des Organs auch bei einer massiven Gewebeschädigung aufrechterhalten werden können (Pfaller und Gstraunthaler 1998). Zum anderen kann geschädigtes Gewebe in der Niere sehr schnell wieder repariert und die Funktionsfähigkeit wiederhergestellt werden (Regeneration). Insbesondere bei einem langsamen, progressiven Verlauf der Nierenschädigung, beispielsweise infolge einer chronischen Exposition gegenüber Nephrotoxinen, stellt die Messung der Nierenfunktion an sich somit eine unzureichende Methode zur Diagnose von Nierenschäden dar. Daher werden Substanzen mit chronisch nierenschädigenden 1 Einleitung 2 Wirkungen bei toxikologischen Prüfverfahren, z.B. während der Arzneistoffentwicklung, nicht selten erst in einer späten Testphase identifiziert, nachdem bereits ein hoher Aufwand an Kosten, Zeit und Versuchstieren betrieben wurde. Große Probleme bereiten die unzureichenden Möglichkeiten zur frühen Diagnose einer Nierenschädigung auch in der Klinik, da sich ein spätes Stadium einer Niereninsuffizienz meist nur noch mit einer Nierenersatztherapie (Dialyse oder Nierentransplantation) behandeln lässt. Dies ist nicht nur mit sehr hohen Kosten verbunden, sondern beeinträchtigt zudem stark die Lebensqualität der betroffenen Personen. Außerdem besitzen diese Patienten eine deutlich verringerte Lebenserwartung (Frei und Schober-Halstenberg 2006; Levey et al., 2007). Es ist jedoch bekannt, dass sich chronische Nierenerkrankungen bei besseren Methoden zur Früherkennung sehr viel einfacher und besser behandeln ließen und der Eintritt von Spätfolgen verlangsamt werden könnte (El Nahas 2005).

Sensitive Indikatoren für eine Nierenschädigung werden nicht nur in der Klinik dringend benötigt, um frühe Stadien von Nierenerkrankungen besser zu diagnostizieren und damit besser therapieren zu können. Auch in der Toxikologie könnten empfindliche Marker für Nephrotoxizität zu einer deutlichen Verbesserung der Testverfahren führen.

Daher ist es ein wichtiges Ziel, Methoden zu entwickeln, mit denen nephrotoxische Eigenschaften von Chemikalien früher und zuverlässiger nachgewiesen werden können. Zum einen könnten durch eine frühe Identifizierung nierentoxischer Substanzen Dauer, Kosten und Versuchstierzahl von Studien im Tier reduziert werden und es wäre leichter möglich, verschiedene, pharmakologisch ähnliche Substanzen hinsichtlich ihrer Verträglichkeit parallel zu testen (screening). Des weiteren bieten sich dadurch auch Ansätze für eine alternative Testung in vitro als Ergänzung bzw. Ersatz von Tierexperimenten.

1.2 Zielorgan Niere

1.2.1 Struktur und Funktionen der Niere Die Nieren sind paarige Organe, die im Retroperitonealraum liegen. Eine der wichtigsten Funktionen der Niere besteht darin, Abfallprodukte des Stoffwechsels (z.B.

Harnstoff) oder Fremdstoffe wie Arzneimittel oder Umweltchemikalien aus dem Blut zu filtrieren und auszuscheiden, um eine Anreicherung zu toxischen Konzentrationen zu verhindern. Zu diesem Zweck produzieren die Nieren aus dem Filtrat stark 1 Einleitung 3 konzentrierten Urin, der über das Nierenbecken und die Harnleiter in die Blase geleitet wird (Abb. 1.1a). Neben dieser Funktion ist die Niere auch wesentlich an der Erhaltung des Wasserhaushaltes, am Metabolismus von Fremdstoffen und der Synthese von Hormonen beteiligt (Khan und Alden 2002; Sands und Verlander 2005).

–  –  –

Abb. 1.1: (a) Anatomische Lage der Nieren; (b) Schematischer Längsschnitt durch eine Rattenniere; um die relative Lage in der Niere anzuzeigen, sind exemplarisch zwei Nephrone eingezeichnet (vergrößerter Bildausschnitt s. Abb. 1.2).



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