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«Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. der Fakultät für Biologie an der Universität Duisburg-Essen vorgelegt von ...»

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Experimentelle Neuro-Onkogenese in der Ratte:

Identifizierung von Genen, welche das Krebsrisiko in

geschlechtsspezifischer Weise modifizieren

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

Dr. rer. nat.

der Fakultät für

Biologie

an der

Universität Duisburg-Essen

vorgelegt von

Linda van den Berg

aus Oberhausen (Rheinland)

Mai 2013

Die Arbeiten für die vorliegende Dissertation wurden in der Zeit von August 2010 bis Mai

2013 unter der Leitung von PD Dr. med. Andrea Kindler-Röhrborn am Institut für Pathologie und Neuropathologie, Universitätsklinikum Essen, Universität Duisburg-Essen, angefertigt.

1. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Jürgen Thomale

2. Gutachter: PD Dr. med. Andrea Kindler-Röhrborn Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. rer. nat. Daniel Hering Tag der mündlichen Prüfung: 18.09.2013 I

INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis……………………………………………….………………………..........V Abbildungsverzeichnis…………………………………………………………..……………….....VII Tabellenverzeichnis………………………………………………………………….………………IX

1. Einleitung

1.1 Die Entstehung von Tumorerkrankungen

1.1.1 Epidemiologie

1.1.2 Exogene Faktoren

1.1.3 Genetische Risikofaktoren

1.2 Tumoren als komplexe genetische Erkrankungen

1.3 Die Identifizierung von Suszeptibilitäts- und Resistenzgenen

1.4 Das BDIX/BDIV Rattenmodell

1.4.1 Mutagene Wirkung von Ethylnitrosoharnstoff

1.4.2 Tumorigenese und mögliche Mechanismen der Tumorresistenz

1.4.4 Suszeptibilitäts- bzw. Resistenz-vermittelnde Loci

1.5 Zielsetzung des vorliegenden Promotionsvorhabens

2. Material

2.1 Versuchstiere

2.2 Geräte

2.3 Verbrauchsmaterialien

2.4 Chemikalien

2.5 Kits und Fertiglösungen

2.6 Antikörper

2.7 Zelllinien und Proteinlysate

2.8 Software und Datenbanken

2.9 Primer-Design

2.10 Puffer und Lösungen

3. Methoden

3.1 Genotypisierung der Nachkommen aus Kreuzungen der BDIX und BDIV Stämme mit Hilfe polymorpher Mikrosatellitenmarker

3.1.1 „Quick and Dirty“ DNA-Isolation

3.1.2 „Mikrosatelliten-PCR“

3.1.3 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese einzelsträngiger DNA.............22 3.1.4 Silberfärbung

3.2 PCR zur Genotypisierung von „βerKO“ Mäusen

3.3 Kanzerogen-Behandlung

3.4 Entnahme von Organen und Isolation von hämatopoetischen Zellen

3.4.1 Organpräparation

3.4.2 Isolation von Zellen des Immunsystems aus dem Peritoneum

3.4.3 Isolation von Lymphozyten aus dem Blut

3.5 Zellkultivierung

II

INHALTSVERZEICHNIS

3.6 Aufbereitung Formalin-fixierter Gewebe

3.7 Aufbereitung kryokonservierter Gewebe

3.7.1 DNA-Isolation

3.7.2 RNA-Isolation

3.7.3 Protein-Isolation

3.7.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

3.7.5 Konzentrationsbestimmung von Proteinen

3.8 Sequenzierung regulatorischer und proteinkodierender Bereiche der Kandidatengene im Mss4 Locus und Vergleich der BDIX und BDIV Allele

3.8.1 PCR

3.8.2 One-Step RT-PCR

3.8.3 Native Agarosegel-Elektrophorese

3.8.4 Aufreinigung von PCR-Produkten

3.8.5 Sequenzierung

3.9 Vergleichende Analysen der mRNA Expression von Kandidatengenen in den Trigeminusnerven von BDIX und BDIV Ratten beider Geschlechter

3.9.1 cDNA-Synthese

3.9.2 Realtime PCR

3.9.3 Auswertung

3.10 Analyse der Proteinexpression von Kandidatengenen im Mss4 Locus in Geweben von BDIX und BDIV Ratten beider Geschlechter

3.10.1 SDS-PAGE und Western Blot

3.10.2 Immunhistochemische Färbungen

3.10.3 Hämalaun-Färbung

3.10.4 Naphthol AS-D Chloracetat-Esterase-Färbung

3.11 Durchflusszytometrie

3.11.1 Zellzählung

3.11.2 Immunfärbung

3.11.3 Durchflusszytometrische Analyse und Auswertung der Daten

3.12 Kaplan Meier Analyse der Überlebenszeiten und statistische Auswertung...............42

3.13 Auswertung der Microarray Daten

4. Ergebnisse

4.1 Feinkartierung des Mss4 Locus auf Chr. 6

4.1.1 Zucht kongener und subkongener Rattenstämme

4.1.2 Genomische Charakterisierung der kongenen und subkongenen Stämme..........45 4.1.3 Effekt der kongenen und subkongenen BDIV Fragmente Mss4b, Mss4c und Mss4d auf die Tumorinzidenz und Überlebenszeit

4.1.4 Geschlechtsspezifische Effekte der BDIV Inserts Mss4b und Mss4d

4.2 Identifizierung von Kandidatengenen im Mss4 Locus

4.2.1 Positionelle Kandidatengene

4.2.2 Sequenzanalyse der Kandidatengene im Mss4 Locus

4.2.3 Relative mRNA Expression in den Trigeminusnerven der Stämme BDIX, BDIV und BDIX.BDIV-Mss4a am Postnataltag 85

4.2.4 Rangfolge der Kandidatengene auf der Basis von Sequenz-, Expressions- und Funktionsdaten





–  –  –

4.3 Glutathionperoxidase 2

4.3.1 Transkriptionsfaktorbindestellen in der Promotorregion von Gpx2

4.3.2 Gpx2 Expression auf Proteinebene

4.4 Östrogenrezeptor beta: Transkriptanalysen in Wildtyp und βerKO Mäusen...........80

4.5 Immunhistochemische Charakterisierung der prämalignen Zellen in den Trigeminusnerven von weiblichen und männlichen BDIX.BDIV-Mss4d Ratten.................84 4.5.1 Ngfr

4.5.2 Cyclin D1

5. Diskussion

5.1 Feinkartierung des Mss4 Locus

5.2 Geschlechtsspezifische Effekte der kongenen und subkongenen BDIV Fragmente Mss4a, Mss4b und Mss4d

5.3 Identifizierung potentiell bedeutsamer Kandidatengene im Hinblick auf den geschlechtsspezifischen Tumorresistenz-Effekt des Mss4 Locus

5.3.1 Glutathionperoxidase 2 (Gpx2)

5.3.2 Östrogenrezeptor Beta (Esr2)

5.4 Charakterisierung der zellulären Vorgänge in Trigeminusnerven ENU-behandelter BDIX.BDIV-Mss4d Ratten

Abstract

Ausblick

Literaturverzeichnis

Anhang 1

Anhang 2

Anhang 3

Anhang 4

Danksagung

Lebenslauf

Publikationen………………………………………………………………………………….……119

–  –  –

Abkürzungsverzeichnis xg x-fache Erdbeschleunigung µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer µM Mikromolar Abb. Abbildung A. dest. Aqua destillata APES 3-Aminopropyltriethoxysilan APS Ammoniumpersulfat ARE Antioxidant response element, Antioxidant responsives Element AS Aminosäure ASDCL AS-D-Chloroacetat Esterase BD-Ratten Berlin Druckrey Ratten BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Basenpaar(e) BSA Bovines Serumalbumin cDNA complementary DNA; komplementäre DNA Chr. Chromosom DAB Diaminobenzidin DNA Deoxyribonucleic acid; Desoxyribonukleinsäure DBD DNA-bindende Domäne ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DPBS Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline DTT Dithioerythritol EDTA Ethylendiamintetraacetat ENU Ethylnitrosourea; Ethylnitrosoharnstoff ERE Estrogen response element, Östrogen responsives Element F2 Filialgeneration 2 FACS Fluorescence activated cell sorting FSC Forward Scatter; Vorwärtsstreulicht G Gauge g Gramm GC Guanin/Cytosin GWAS Genomweite Assoziationsstudie h Hour; Stunde(n) HRP horseraddish peroxidase; Meerrettichperoxidase kb Kilobasen kDa Kilo Dalton KO Knockout l Liter mA Milliampere mb Megabasen mg Milligramm Minute Min.

V II

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ml Milliliter MPNST Maligner peripherer Nervenscheidentumor mRNA messenger RNA; Boten-RNA Mss Mediating Schwannoma Susceptibility NaOH Natriumhydroxid ng Nanogramm nm Nanometer PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese PCR Polymerase Chain Reaction; Polymerasekettenreaktion PND Postnatal Day; Postnataltag PNS Peripheres Nervensystem RNA Ribonucleic acid; Ribonukleinsäure RNO Rattenchromosom Nummer ROS Reactive Oxygen Species; Reaktive Sauerstoffspezies RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction SDS Sodiumdodecylsulfate; Natriumdodecylsulfat Sek. Sekunde SNP Single nucleotide polymorphism; Einzelnukleotid-Polymorphismus SSC Side Scatter; Seitwärtsstreulicht Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TBS Tris Buffered Saline TEMED Tetramethylethylendiamin Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U Units UTR Untranslated Region; Untranslatierte Region UV Ultraviolett V Volt W Watt

–  –  –

Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Zelluläre und molekulare Prozesse in den Trigeminusnerven von BDIX und BDIV Ratten in Folge der Ethylnitrosoharnstoff-Exposition am PND1.

Abb. 2 Lokalisierung der Mss Loci im Genom der BDIX bzw. BDIV Ratten und ihre Effekte auf das MPNST Risiko

Abb. 3 Gelelektrophorese der PCR-Produkte der Mikrosatelliten-gestützen Genotypisierung von Ratten zur Erzeugung kongener und subkongener Stämme beispielhaft dargestellt am Marker D6Rat72

Abb. 4 Physikalische Lage der kongenen und sub-kongenen BDIV Fragmente Mss4a, Mss4b, Mss4c und Mss4d im BDIX Genom in Bezug auf den Tumor-resistenzhaplotyp.

Abb. 5 Kaplan Meier Analyse der Überlebenszeiten der Stämme BDIX und BDIV nach ENUExposition am PND1

Abb. 6 Vergleich der Kaplan Meier Überlebenskurven von Ratten der Stämme BDIX, BDIX.BDIVMss4a, -Mss4b, -Mss4c und –Mss4d nach ENU-Exposition am PND1.

Abb. 7 Geschlechtsgetrennte Kaplan Meier Analyse der Überlebenszeiten der Tiere des BDIX und BDIV Stammes nach ENU-Exposition am PND1.

Abb. 8 Geschlechtsgetrennte Kaplan Meier Analyse der Überlebenszeiten der Stämme BDIX.BDIVMss4a, -Mss4b und -Mss4d nach ENU-Exposition am PND1.

Abb. 9 Kaplan Meier Analyse der Überlebenszeiten weiblicher Ratten der Stämme BDIX, BDIX.BDIVMss4a, -Mss4b und -Mss4d nach ENU-Exposition am PND1.

Abb. 10 Kaplan Meier Analyse der Überlebenskurven von männlichen Ratten der Stämme BDIX, BDIX.BDIV-Mss4a, -Mss4b und -Mss4d nach ENU-Exposition am PND1.

Abb. 11 A) MPNST-Inzidenzen (%) am Tag 200 und B) mediane Überlebenszeiten der Stämme BDIX, BDIV, BDIX.BDIV-Mss4a, -Mss4b, -Mss4c und –Mss4d beider Geschlechter nach ENUExposition am PND1

Abb. 12 Physikalische Lage und Struktur der Kandidatengene im Überlappungsbereich der BDIV Fragmente Mss4a und Mss4d auf Chr. 6.

Abb. 13 Transkriptionsfaktor-Bindestellen im Gpx2 Promotor, die den SNP A) 15 bp und B) 53 bp vor Transkriptionsstart umfassen

Abb. 14 Vergleich der Spezifität der Gpx2-Antikörper ab64322 und GBF mittels Western Blot Analyse im Kolon und in HepG2-Zellen

Abb. 15 Immunhistochemische Analyse der Gpx2 Expression im Kolon der Ratte

Abb. 16 Immunhistochemische Analyse der Gpx2 Expression in der Milz.

Abb. 17 Immunhistochemische Analyse der Gpx2 Expression in Lymphknoten.

Abb. 18 Immunhistochemische Analyse der Gpx2 Expression im Thymus

Abb. 19 Mastzellnachweis und immunhistochemische Analyse der Gpx2-Expression in Gewebsmastzellen der Trigeminusnerven ENU-behandelter Ratten

Abb. 20 Mastzellnachweis und immunhistochemische Analyse der Gpx2 Expression in Gewebsmastzellen in MPNSTs ENU-behandelter Ratten

Abb. 21 Western Blot Analyse der Gpx2-Expression in peritonealen Immunzellen von BDIX- und BDIV-Ratten beider Geschlechter.

–  –  –

Abb. 22 Identifizierung von Mastzellen und Makrophagen im Peritonealexudat von BDIX und BDIV Ratten.

Abb. 23 Immunhistochemische Analyse der Gpx2 Expression in peritonealen Mastzellen von weiblichen und männlichen Ratten der Stämme BDIX und BDIV.

Abb. 24 Identifizierung und Charakterisierung von peritonealen Immunzellen der Ratte mittels FACSAnalyse.

Abb. 25 FACS-Analyse der Gpx2 Expression in peritonealen Mastzellen von BDIX und BDIV Ratten beider Geschlechter

Abb. 26 Genotypisierung von Mäusen für die Esr2 Transkriptanalyse in KO Tieren

Abb. 27 PCR-Nachweis der Esr2 Transkripte (Exon 2 - 6) in den Trigeminusnerven einer Wildtyp und βerKO Maus

Abb. 28 PCR-Nachweis von Esr2 Transkripten (Exon 2 – 3 und 5 – 6) im Ovar einer Wildtyp, C57Bl/6 und βerKO Maus

Abb. 29 PCR-Nachweis von Esr2 Transkripten (Exon 2, 3, 4) im Ovar einer Wildtyp, C57Bl/6 und βerKO Maus

Abb. 30 Mittels PCR identifizierte Abschnitte der Esr2 mRNA in Wildtyp und βerKO Mäusen............ 83 Abb. 31 Immunhistochemische Analyse der Ngfr-Expression in prämalignen Schwann Zellen in einem Trigeminusnerv eines ENU-behandelten männlichen und weiblichen BDIX.BDIV-Mss4d Tieres und im MPNSTs eines 245 Tage alten BDIX.BDIV-Mss4b Männchens.

Abb. 32 Immunhistochemische Analyse der Cyclin D1-Expression in pämalignen Schwann Zellen in einem Trigeminusnerv eines ENU-behandelten BDIX.BDIV-Mss4d Männchens und Weibchens und einem MPNST eines 245 Tage alten BDIX.BDIV-Mss4b Männchens.

–  –  –

Tabellenverzeichnis Tab. 1 Geräte.

Tab. 2 Verbrauchsmaterialien.

Tab. 3 Chemikalien

Tab. 4 Kits und Fertiglösungen.

Tab. 5 Primärantikörper

Tab. 6 Sekundärantikörper und -reagenzien

Tab. 7 Antikörper-Verdünnungen für den Western Blot.

Tab. 8 Antikörper-Verdünnungen für die Immunhistochemie

Tab. 9 Fluorophore und deren Emmissionsspektren für die FACS-Analyse.

Tab. 10 Paarweiser Vergleich der Kaplan Meier Überlebenskurven der Stämme BDIX, BDIX.BDIVMss4a, -Mss4b, -Mss4c und -Mss4d nach ENU-Exposition am PND1

Tab. 11 Paarweiser Vergleich der Kaplan Meier Überlebenskurven weiblicher Tiere der Stämme BDIX, BDIX.BDIV-Mss4a, Mss4b und -Mss4d nach ENU-Exposition am PND1

Tab. 12 Paarweiser Vergleich der Kaplan Meier Überlebenskurven männlicher Tiere der Stämme BDIX, BDIX.BDIV-Mss4a, -Mss4b und -Mss4d nach ENU-Exposition am PND1.

Tab. 13 Kaplan Meier Analyse der Überlebenszeiten und Tumorinzidenzen weiblicher und männlicher Ratten der Stämme BDIX, BDIX.BDIV-Mss4a, -Mss4b, -Mss4c und –Mss4d nach ENUExposition am PND1



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