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«Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg ...»

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Funktionelle Charakterisierung eines

LysM-Proteins von

Ustilago maydis

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

Dem Fachbereich Biologie

der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Nancy Stolle

aus Zwickau

Marburg/Lahn, 2013

Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden von Oktober 2009 bis April 2013

unter Betreuung von Frau Prof. Dr. Regine Kahmann in Marburg am Max-Planck-Institut

für terrestrische Mikrobiologie in der Abteilung Organismische Interaktionen durchgeführt.

Vom Fachbereich der Philipps-Universität Marburg als Dissertation angenommen am: _07.06.2013___________________

Erstgutachter: Frau Prof. Dr. Regine Kahmann Zweitgutachter: Herr Prof. Dr. Michael Bölker Tag der mündlichen Prüfung: ____13.06.2013________________

Erklärung Ich versichere, dass ich meine Dissertation mit dem Titel „Funktionelle Charakterisierung eines LysM-Proteins von Ustilago maydis“ selbstständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfsmittel bedient habe.

Diese Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken gedient.

Name (Ort/Datum) Zwei Dinge sind zu unserer Arbeit nötig: Unermüdliche Ausdauer und die Bereitschaft, etwas, in das man viel Zeit und Mühen gesteckt hat, wieder wegzuwerfen Albert Einstein (1879-1955) Zusammenfassung I Zusammenfassung Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, ist für die Etablierung einer kompatiblen Interaktion mit seiner Wirtspflanze Zea mays auf die Sekretion zahlreicher Effektorproteine angewiesen. Zu solchen Effektoren gehören sekretierte LysM-Proteine phytopathogener Pilze. LysM-Proteine können essentielle Virulenzfaktoren sein, indem sie Chito-Oligosaccharide, welche durch pflanzliche Chitinasen aus der pilzlichen Zellwand freigesetzt wurden, abfangen und dadurch eine PAMP-vermittelte Resistenz der Pflanze unterdrücken. Im Genom von U. maydis wurde ein für ein LysM-Protein kodierendes Gen (um11464) identifiziert und näher untersucht. Die Deletion von um11464 führte zu einem hypervirulenten Phänotyp in Pflanze. Eine detaillierte phänotypische Charakterisierung eines um11464 Deletionsstammes ergab, dass dieser eine veränderte Morphologie in Flüssigkultur sowie eine erhöhte Sensitivität gegenüber Zellwandstressoren aufwies.

Ferner wirkte sich die Deletion von um11464 positiv auf die Filament- und Appressorienbildung aus. Die Penetrationseffizienz des Stammes SG200∆um11464 war hingegen im Vergleich zu SG200 unverändert.

Sekretionsanalysen zeigten, dass das Signalpeptid von Um11464 funktionell war.

Um11464 konnte jedoch zu keinem Zeitpunkt in Kulturüberständen nachgewiesen werden.

Durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie und Immunmarkierungen wurde gezeigt, dass das Protein in der pilzlichen Zellwand lokalisiert. Es wurde eine C-terminale Verankerung über nicht-kovalente Verknüpfungen nachgewiesen. Eine Interaktion mit Chitin oder anderen pilzlichen Zellwandbestandteilen konnte durch PolysaccharidBindeversuche mit rekombinantem Um11464 nicht bestätigt werden.

Der positive Effekt der um11464 Deletion auf die Differenzierungsprozesse vor der Penetration sowie die Virulenz von U. maydis könnte andeuten, dass Um11464 eine veränderte Pflanzenreaktion hervorruft. Um dies zu untersuchen, wurden vergleichende Mais-Transkriptomanalysen durchgeführt. Diese zeigten, dass eine Vielzahl abwehrinduzierter Pflanzengene, darunter einige Transkriptionsfaktoren, spezifisch nach Infektion mit der um11464 Deletionsmutante herunterreguliert wurden, was eine aktive Unterdrückung der pflanzlichen Abwehr bedeuten könnte.

Summary II

Summary

Ustilago maydis, the causal agent of corn smut, depends on the secretion of various effector proteins in order to guarantee the establishment of a biotrophic interaction with its host plant Zea mays. Secreted LysM proteins in phytopathogenic fungi have been shown to play an essential role as virulence factors, since they are able to sequester chitooligosaccarides that were released by plant chitinases, thereby preventing PAMP-triggered immunity. In that respect, one gene (um11464) encoding for a LysM-containing protein has been identified in the genome of U. maydis. In this study it was shown that the deletion of um11464 resulted in a hypervirulent phenotype in planta. A detailed phenotypical characterization of an um11464 deletion strain revealed that this strain shows a morphological phenotype in axenic culture as well as enhanced sensitivity towards cell wall stressors. Furthermore, the deletion of um11464 was shown to positively influence filament and appressoria formation, although the penetration efficiency of SG200∆um11464 was not impaired.

Secretion assays revealed that the signal peptide of Um11464 is functionally active.

However, Um11464 could never be detected in the culture supernatant.

Using confocal microscopy and immuno-labelling, Um11464 could be localized within the fungal cell wall. It could be shown that the protein binds non-covalently to the cell wall.

However, polysaccharide binding assays revealed, that the attachment might not be achieved through binding to chitin or any other cell wall component.





The positive effect of the um11464 deletion on differentiation and virulence could indicate that Um11464 might change plant defense responses. Transcriptional profiling of infected maize plants revealed that several plant genes involved in defense responses were indeed significantly induced in response to the um11464 deletion strain. This suggests that plant defense responses are actively suppressed after um11464 deletion.

Abkürzungen und Fachbegriffe III

–  –  –

ZUSAMMENFASSUNG

SUMMARY

ABKÜRZUNGEN UND FACHBEGRIFFE

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG

1.1 Das pflanzliche Immunsystem

1.2 LysM Proteine

1.2.1 Die Funktion von LysM-Proteinen in Bakterien

1.2.2 Die Funktion von LysM-Proteinen in Pilzen

1.2.3 Die Rolle von LysM Proteinen im pflanzlichen Immunsystem

1.3 Der Maisbeulenbrand Ustilago maydis

1.3.1 Der Lebenszyklus von U. maydis

1.3.2 Die Rolle sekretierter Effektoren im U. maydis / Z. mays Pathosystem

1.4 Fragestellung dieser Arbeit

2 ERGEBNISSE

2.1 Domänenarchitektur des LysM-Proteins Um11464

2.2 Regulation der um11464 Expression während des Lebenszyklus von U. maydis............ 12

2.3 Die Rolle von Um11464 während der saprophytischen Wachstumsphase

2.3.1 Um11464 beeinflusst die Zellmorphologie in axenischer Kultur

2.3.2 Um11464 wird für eine effiziente Septenbildung benötigt

2.3.3 Die Deletion von um11464 erhöht die Sensitivität gegenüber Zellwandstressoren............. 15

2.4 Die Rolle von Um11464 während der pathogenen Entwicklung von U. maydis.............. 16 2.4.1 Um11464 wirkt sich negativ auf die Virulenz aus

2.4.2 Die Überexpression von um11464 reduziert die Tumorbildung in Pflanze

Der ∆um11464 Virulenzphänotyp kann durch das S. reilianum Ortholog partiell 2.4.3 komplementiert werden

2.4.4 Die Kolonisation von Pflanzengewebe wird durch Um11464 nicht beeinflusst................. 19

2.5 Die Rolle von Um11464 bei der Bildung von Infektionsstrukturen

2.5.1 Die um11464 Mutante zeigt eine verstärkte Reaktion auf Hydroxy-Fettsäuren.................. 21 2.5.2 Die um11464 Mutante bildet verstärkt Appressorien auf der Blattoberfläche

Inhaltsverzeichnis V 2.5.3 Die Penetration der Pflanzenoberfläche wird durch Um11464 nicht beeinflusst................ 23 2.5.4 Die Oberflächenhydrophobizität von Hyphen wird durch Um11464 nicht beeinflusst....... 24

2.6 Transkriptionelle Reaktion der Pflanze auf Infektion mit der um11464 Mutante.......... 25

2.7 Heterologe Expression von Um11464

2.7.1 Rekombinante Proteinsynthese in E. coli und Gewinnung polyklonaler Antikörper.......... 30 2.7.2 Rekombinante Proteinsynthese in N. benthamiana

2.7.3 Heterolog exprimiertes Um11464 Protein interagiert nicht mit Polysacchariden............... 33

2.8 Lokalisationsstudien zu Um11464

2.8.1 Verifizierung der Funktionalität des N-terminalen Signalpeptids von Um11464............... 34 2.8.2 Analyse der Um11464 Sekretion in Sporidien und b-abhängigen Filamenten

2.8.3 Untersuchungen zur Modifikation von Um11464

2.8.4 Um11464 lokalisiert in der pilzlichen Zellwand

2.8.5 Um11464 ist mit der pilzlichen Zellwand assoziiert

2.8.6 Die nicht-kovalente Zellwandassoziation von Um11464 wird durch den C-Terminus bewerkstelligt

3 DISKUSSION

3.1 Das LysM-Protein Um11464

3.2 Um11464 reguliert die Zellwandbeschaffenheit von U. maydis

3.3 Um11464 lokalisiert in der pilzlichen Zellwand

3.4 Um11464 wirkt sich negativ auf die pathogene Entwicklung von U. maydis aus............ 57

3.5 Um11464 bedingt eine veränderte Pflanzenreaktion

4 MATERIAL UND METHODEN

4.1 Material und Bezugsquellen

4.1.1 Chemikalien

4.1.2 Puffer und Lösungen

4.1.3 Enzyme und Antikörper

4.1.4 Verwendete Kits

4.2 Zellkultivierung

4.2.1 Kultivierung von E.coli und A. tumefaciens

4.2.2 Kultivierung von U. maydis

4.2.3 Kultivierung von Hefen

4.2.4 Bestimmung der Zelldichte

4.3 Stämme, Oligonukleotide und Vektoren

4.3.1 Mais- (Zea mays spec.) und Tabakvarietäten (Nicotiana spec.)

4.3.2 E. coli Stämme

Inhaltsverzeichnis VI 4.3.3 A. tumefaciens Stämme

4.3.4 Hefe-Stämme

4.3.5 U. maydis Stämme

4.3.6 Oligonukleotide

4.3.7 Plasmide

4.4 Mikrobiologische und zellbiologische Methoden

4.4.1 Transformationen

4.4.2 Filament- und Appressorieninduktion in vitro

4.4.3 Bestimmung der Oberflächenhydrophobizität

4.4.4 Pathogenitätstest von U. maydis

4.5 Molekularbiologische Methoden

4.5.1 Isolierung von Nukleinsäuren

4.5.2 In vitro Modifikation von Nukleinsäuren

4.5.3 Auftrennung und Nachweis von Nukleinsäuren

4.6 Biochemische Methoden

4.6.1 Gewinnung von Proteinextrakten

4.6.2 Proteinbestimmung nach Bradford

4.6.3 Proteinfällung

4.6.4 Auftrennung und Nachweis von Proteinen

4.6.5 Bestimmung post-translationaler Proteinmodifikationen

4.6.6 Heterologe Expression von Um11464

4.6.7 Polysaccharid-Bindungs-Versuche

4.7 Färbungen

4.7.1 Färbung mit Calcofluor white

4.7.2 Färbung mit WGA/Alexafluor-488 und Propidium-Iodid

4.7.3 Biotinylierung von Zelloberflächen

4.7.4 In situ Immunofluoreszenz

4.8 Mikroskopie und Bildverarbeitung

4.9 Transkriptom-Analysen mittels RNASeq

4.9.1 RNA-Präparation

4.9.2 „Library“-Konstruktion

4.9.3 Datenanalyse

4.10 Bioinformatische Analysen

5 LITERATUR

–  –  –

1.1 Das pflanzliche Immunsystem Pflanzen besitzen ein vielschichtiges Immunsystem, um pathogene Organismen zu erkennen und abzuwehren (Chisholm et al., 2006; da Cunha et al., 2006; de Wit, 2007).

Dabei nehmen sie in einem ersten Schritt die durch das Pathogen freigesetzten, konservierten Moleküle, die sogenannten MAMPs oder PAMPs („microbial/pathogenassociated molecular pattern“) wie z.B. das bakterielle Flagellin oder Chitin der pilzlichen Zellwand, war. Dies geschieht über spezifische Membranrezeptoren (PRRs: „pattern recognition receptor“) und führt zu einer basalen Abwehr, die sich durch eine Erhöhung der intrazellulären Ionenflüsse, die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies, CalloseDepositionen und somit Stärkung der pflanzlichen Zellwand sowie durch Aktivierung intrazellulärer MAPK-Kaskaden äußert (Ausubel, 2005; Zipfel, 2008). Man spricht hierbei von einer PAMP-vermittelten Resistenz (PTI) der Pflanze (Chisholm et al., 2006; Jones und Dangl, 2006). Diese kann durch sekretierte Virulenzfaktoren des Pathogens, auch Effektoren genannt, erfolgreich unterdrückt werden, was als „effector-triggered susceptibility“ (ETS) bezeichnet wird (Jones und Dangl, 2006). Die Pflanze ist jedoch häufig in der Lage, diese Effektorproteine zu erkennen und den Eindringling durch die Aktivierung eines sekundären Immunsystems abzuwehren (ETI: „effector-triggered immunity“). Hierbei spielen sogenannte Resistenzproteine (R-Proteine) eine zentrale Rolle, die neben der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies eine Reihe weiterer Abwehrmechanismen seitens der Wirtspflanze in Gang setzen. Im Falle eines biotrophen Eindringlings kommt es unter anderem zur Aktivierung eines Salicylat-abhängigen Signalweges, was zu einer verstärkten hypersensitiven Reaktion der Pflanze in Verbindung mit einem lokalen programmierten Zelltod führt (Bari und Jones, 2009; Glazebrook, 2005).

Im Falle eines nekrotrophen Pathogens, der sich von totem Material ernährt, werden Jasmonat- und Ethylensignalwege induziert (Bari und Jones, 2009).

Der stetige Wettstreit um die besten Waffen bedingt, dass sowohl Effektoren als auch RProteine einem starken Selektionsdruck unterliegen (Koeck et al., 2011). Die Erkennung von MAMPs und PAMPs durch die PRRs und die damit verbundene Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden bestimmt, ob die Pflanze den Orgamismus abwehrt oder einen mutualistischen Austausch eingeht (Müller und Felix, 2012).

Einleitung 2

1.2 LysM Proteine



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