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«Fakultät für Biologie Untersuchungen zur Aufklärung der in vivoFunktion des Zytolysins ClyA von Escherichia coli Dissertation zur Erlangung des ...»

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Julius-Maximilians-Universität Würzburg

Fakultät für Biologie

Untersuchungen zur Aufklärung der in vivoFunktion des Zytolysins ClyA von Escherichia coli

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von:

Christian Hüttinger

aus Würzburg

Würzburg, 2003

Eingereicht am:

Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender:

Gutachter: Prof. Dr. W. Goebel Gutachter: PD Dr. J. Reidl Tag des Promotionskolloquiums

Doktorurkunde ausgehändigt am:

Erklärung Die vorliegende Arbeit wurde am Lehrstuhl für Mikrobiologie der Bayerischen JuliusMaximilians-Universität Würzburg von Juli 1999 bis Juni 2003 unter Betreuung von Prof. Dr.

W. Goebel angefertigt.

Hiermit versichere ich, daß die hier vorliegende Arbeit von mir selbständig und nur unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und Quellen angefertigt wurde. Diese Dissertation hat weder in gleicher noch ähnlicher Form in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen.

Außerdem Titel Diplom-Biologe (Univ.) habe ich bisher keine anderen akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.

Würzburg, den

Meiner Mutter (17.01.1948 - 05.02.2001) To be is to do Socrates To do is to be Satre Do be do be do Ted Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich ganz besonders bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr.

Werner Goebel für die Bereitstellung des Themas und des Arbeitsplatzes sowie der Materialien für die Durchführung meiner Dissertation bedanken.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. med. Volker Brade, durch dessen Interesse und finanzielle Unterstützung der erfolgreiche Abschluß dieser Arbeit erst möglich wurde.

Ebenfalls danke ich Herrn PD Dr. Albrecht Ludwig für seine gute Betreuung und ständige Diskussionsbereitschaft.

Mein Dank gilt außerdem Herrn PD Dr. Joachim Reidl für die Übernahme des Zweitgutachtens dieser Dissertation.

Ein besonderes und herzliches Dankeschön geht an alle meine langjährigen Laborkollegen Dr.

Simone Spreng, Dr. Bernd Schmaußer, Sabine Gfrörer, Dr. Sabine Pilgrim, Jochen Stritzger und Dr. Birgit Bergmann für die wunderbare Arbeitsatmosphäre, ihre Freundschaft und für viele schöne, lustige und aufregende Stunden außerhalb des Labors. Gleiches gilt für Dr.

Christoph Schoen, mit dem ich so manchen Kilometer am Main lief und der mit mir den „Teer“ anzündete, sowie für den „Langen“, Dr. Andreas Bock, dem ich verzweifelt aber mit Erfolg die Grundkenntnisse des Kochens versuchte näher zu bringen und durch den ich den liebsten Mensch der Welt kennenlernen durfte.

–  –  –

A. ZUSAMMENFASSUNG

B. EINLEITUNG

C. MATERIAL UND METHODEN

1. Bakterienstämme

2. Desoxyribonukleinsäuren

2.1 Vektorplasmide

2.2 Rekombinante Plasmide

2.3 Oligonukleotide

3. Chemikalien und Enzyme

4. Geräte

5. Medien und Agarplatten

5.1 Herstellung von Medien und Agarplatten

5.2 Zusätze für Medien und Agarplatten

6. Molekulargenetische Methoden

6.1 Isolierung von Plasmid-DNA

6.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA im analytischen Maßstab

6.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem Nucleobond AX-Plasmid-Kit

6.2 Isolierung chromosomaler DNA

6.2.1 Isolierung chromosomaler DNA aus E. coli und Listeria monocytogenes

6.3 Spaltung von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen

6.4 Horizontale Agarosegel-Elektrophorese

Inhaltsverzeichnis

6.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Isolierung mit Hilfe des „GFX PCR and Gel Band Purification Kits“

6.5.1 6.5.2 Isolierung mit Hilfe des „QIAquick Gel Extration Kits“

6.5.3 Reinigung von DNA-Fragmenten und PCR-Produkten mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“

6.6 Subklonierung von DNA-Fragmenten

6.7 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten am 5‘-Ende durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase

6.8 Herstellung kompetenter Zellen von E. coli DH5α

6.9 Transformation von E. coli 5K und DH5α mit Plasmid-DNA

6.10 Aufbewahrung von Bakterienstämmen

6.11 Herstellung elektrokompetenter Zellen

6.11.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen von E. coli

6.11.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen von L. monocytogenes

6.11.3 Eigentliche Elektroporation

6.12 Amplifizierung von DNA-Fragmenten durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

6.13 Rekombinante PCR

6.14 Sequenzierung nach der Fluoreszenzmethode

6.15 Bakterielle Konjugation

6.16 Southern-Blot

7. Proteinbiochemische Methoden

7.1 Gewinnung von extrazellulären, periplasmatischen und zytoplasmatischen Proteinen

7.1.1 Gewinnung von Überstandsproteinen aus E. coli und L. monocytogenes

7.1.2 Gewinnung der periplasmatischen Proteine aus E. coli durch osmotischen Schock....38

7.2 Auftrennung von Proteinen durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese





7.2.1 Herstellung von SDS-Polyacrylamidgelen und Durchführung der Elektrophorese.....39

7.3 Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen mit Coomassie Brilliant Blue

7.4 Silberfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen

7.5 Trocknen von SDS-Polyacrylamidgelen

Inhaltsverzeichnis

8. Zellkultur

8.1 Herstellung von Listeria-Infektionsaliquots

8.2 Auftauen und Einfrieren von Zellen

8.3 Passagieren von J774-Makrophagen

8.4 Bestimmung der Lebendzellzahl mit Hilfe von Tryptan-Blau

8.5 Infektion

8.6 Bestimmung der Bakterienlebendzellzahl (CFU) in J774-Makrophagen

8.7 Giemsa-Färbung

8.8 Gram-Färbung

8.9 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

9. Aktivitätstest zur Bestimmung der hämolytischen Aktivität

9.1 Vorbereitung der Pferde-Erythrozyten

9.2 Test zur hämolytischen Aktivität des Kulturüberstandes

9.3 Test zur hämolytischen Aktivität der Bakterienkultur (Kontakthämolyse)..................47

9.4 Test zur hämolytischen Aktivität der periplasmatischen Proteine

10. Bestimmung der Zytotoxizität von Bakterien gegenüber eukaryontische Zellen.........47 D. ERGEBNISSE

1. Untersuchungen der Bedeutung von ClyA für enteroinvasive E. coli (EIEC)Stämme

1.1 Herstellung von clyA-Deletionsmutanten der enteroinvasiven E. coli-Stämme EIEC 12860 und EIEC 4608-58

1.1.1 Konstruktion des Suizidplasmids pCH∆clyA

Deletion von clyA aus dem Genom von EIEC 12860(Smr) und 1.1.2 EIEC 4608-58(Smr) mit Hilfe des Suizidplasmids pCH∆clyA

1.1.3 Charakterisierung der clyA-Insertions- und Deletionsmutanten

1.2 Bestimmung der hämolytischen Aktivität der wildtypischen Stämme EIEC 12860∆clyA und EIEC 4608-58∆clyA sowie der entsprechenden clyAMutanten

1.2.1 Phänotypische Charakterisierung der hämolytischen Aktivität

Inhaltsverzeichnis 1.2.2 Untersuchung der hämolytischen Aktivität von EIEC 12860 und EIEC 4608-58, sowie der clyA-Mutanten im Flüssig-Hämolysin-Aktivitätstest

1.3 Überprüfung des Überlebens und der Vermehrung von EIEC-Wildstämmen in J774Makrophagen

1.4 Infektion von J774-Makrophagen mit EIEC 4608-58-Stämmen

1.5 Lichtmikroskopische Analyse von EIEC-infizierten J774-Makrophagen

1.6 Bestimmung der Zytotoxizität von ClyA durch Messung der LDH-Aktivtät...............63

2. Analyse der in vivo-Funktion von ClyA mit Hilfe von Listeria monocytogenes

2.1 Molekulargenetische Charakteristika der Listeria monocytogenes-Stämme DP-L2161 und pKP1

2.1.1 Eigenschaften von L. monocytogenes DP-L2161

2.1.2 Eigenschaften von L. monocytogenes pKP1

2.2 Konstruktion von Plasmiden für die Rekomplementation von L. monocytogenes Deletionsmutanten

2.2.1 Konstruktion von pCH10 und pCH16

2.2.2 Konstruktion von pCH11, pCH15, pCH17 und pCH18

2.2.3 Konstruktion von pCH12, pCH13 und pCH14

2.3 Vergleich der L. monocytogenes-Stämme DP-L2161 und pKP1 mit ihren isogenen Wildtypen und den plasmidkomplementierten Mutanten

2.3.1 Phänotypische Charakterisierung der hämolytischen Aktivität

2.3.2 Untersuchungen der hämolytischen Aktivität im Flüssig-Hämolysin-Aktivitätstest...76

2.4 Infektion von J774-Makrophagen mit L. monocytogenes-Mutanten

2.5 Untersuchungen zur lytischen Aktivität von ClyA auf Listeria monocytogenes Stämme

2.6 Lichtmikroskopische Untersuchungen zur Befreiung der L. monocytogenes-Stämme aus dem Phagosom

2.7 Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Befreiung der L. monocytogenes-Stämme aus dem Phagosom

2.8 Lichtmikroskopische Untersuchungen zur Vermehrung und Ausbreitung der L. monocytogenes-Stämme

Inhaltsverzeichnis E. DISKUSSION

F. LITERATUR

G. ANHANG

Summary

–  –  –

Pore-forming cytolysins are important virulence factors of many pathogenic bacteria. In

E. coli strains, three different pore-forming cytolysins have been identified so far:

α-hemolysin (HlyA), EHEC-hemolysin (EHEC-HlyA; Ehx) and the cryptic hemolysin (ClyA). α-hemolysin and EHEC-hemolysin are frequently produced by uropathogenic and enterohaemorrhagic strains. Both toxins are related cytolysins and belong to a large family referred to as RTX-toxins. Among these, α-hemolysin has been most extensively studied.

Futher experiments have shown that α-hemolysin which is produced by uropathogenic E. coli strains (UPEC), contributes to the virulence of UPEC. Recently, the cryptic hemolysin ClyA, a protein of about 34 kDa showing no homology to any member of the RTX-family was identified in the laboratory strain E. coli K-12. Under standard in-vitro-laboratory conditions ClyA is not produced at detectable levels. Further studies demonstrated that clyA is not only present in E. coli K12 but also a functional clyA-gene has been detected in various pathogenic E. coli isolates (p.e. enteroinvasive E. coli strains). So far, the role of ClyA for the virulence of pathogenic E. coli strains is unknown. Therefore, in that work the in-vivo function of ClyA of pathogenic E. coli strains was investigated. Especially, in enteroinvasive E. coli (EIEC) strains, which are able to replicate intracellulary in mammalian cells and to evade into the cytoplasm of the host cell, the relevance of ClyA for EIEC strains is unknown.

Carefully selected wildtyp EIEC strains (EIEC 12860, EIEC 4608-58) showed a clear hemolytic phenotyp per se and after overproduction of the positive regulatory protein SlyA, respectively, while in ClyA-knock-out-mutants of these wildtyp EIEC strains a hemolytic phenotyp has never been observed. All these findings indicate that ClyA is expressed in significant amounts in wildtyp EIEC strains under standard in-vitro-laboratory conditions.

Further infection studies with J774 macrophages by using the EIEC strain 4608-58 and a isogenic ClyA deletion mutante, respectively, revealed that ClyA is a strong cytolysin in wildtyp EIEC strains, which contributes to the cytotoxicity of these wildtyp EIEC strains. But a special relevance of ClyA for the intracellulary growth of EIEC could not be seen in any of these experiments.

Recent studies showed that the facultative intracellulary bacteria Listeria monocytogenes produce the poreforming toxin listeriolysin O (LLO), which allows L. monocytogenes by opening the phagosomal membrane to evade into the cytoplasma of the host cell after invasion into a phagocytic cells. However, the mechanism which allows EIEC Summary strains to penetrate the phagosomal membran is still unknown. ClyA might play a similar role for opening the phagosomal membran after invasion of EIEC into host cells. In this work it has been investigated wether ClyA of E. coli might functionally replace LLO of L. monocytogenes. In addition, L. monocytogenes LLO mutants which have a chromosomal deletion of the LLO gene and thereby lost the ability to produce LLO, were complemented with several plasmids. These plasmids carrying clyA and clyA-derivates under the control of the listeriolysin O promotorregion, respectively, were substituted for the listeriolysin O gene in the L. monocytogenes LLO mutants. Some of the recombinant L. monocytogenes strains expressed ClyA and showed hemolytic activity and a hemolytic phenotyp. Further experiments with J774 macrophages revealed that some of these recombinant L. monocytogenes strains seemed to open the phagosomal membrane. In consequence some bacteria were able to escape from the phagosomal compartment, but were not able to grow in the cytosol of infected cells. However, when ClyA were expressed in recombinant L. monocytogenes strains, a fully virulence phenotype could not be restored in-vitro.

Due to these findings, ClyA of E. coli might be involved in the opening of the phagosomal membrane and the virulence of EIEC strains.

Zusammenfassung

A. ZUSAMMENFASSUNG

Porenbildende Zytolysine stellen wichtige Virulenzfaktoren von vielen pathogenen Bakterien dar. In Escherichia coli-Stämmen wurden bisher drei verschiedene porenbildende Zytolysine identifiziert, nämlich das α-Hämolysin (HlyA), das EHEC-Hämolysin (EHEC-HlyA, Ehx) und das latente Hämolysin ClyA. α-Hämolysin und EHEC-Hämolysin, die beide zur Familie der RTX-Toxine gehören, werden häufig von uropathogenen bzw. enterohämorrhagischen E.



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