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«zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg vorgelegt von ...»

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INAUGURAL - DISSERTATION

zur

Erlangung der Doktorwürde

der

Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät

der

Ruprecht-Karls-Universität

Heidelberg

vorgelegt von

Diplom-Biologe Jochen Bogin

aus Germersheim

Tag der mündlichen Prüfung: 14.06.2004

Thema

Identifizierung und Charakterisierung

von Interaktionspartnern der

Janus-Kinase Hopscotch in

Drosophila melanogaster

Gutachter: PD Dr. Frank Sauer

Department of Biochemistry, University of California at Riverside Prof. Dr. Dr. h. c. Konrad Beyreuther Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg Diese Arbeit wurde erstellt am Zentrum für Molekulare Biologie der Ruprecht-KarlsUniversität Heidelberg und am Department of Biochemistry, University of California at Riverside unter der Leitung von PD Dr. Frank Sauer.

Vorab möchte ich Frank für die Bereitstellung des interessanten Themas und seine Unterstützung während der Durchführung des Projekts danken.

Ebenso möchte ich mich herzlich bei Christian, Simona und Thorsten bedanken, die mich als Vertreter des „alten“ Labors auch bis zum Schluss mit kreativem Rat und moralischer Unterstützung gefüttert haben. Mein Dank gilt ihnen ebenso für die anspruchsvolle Durchsicht des Manuskripts und die daraus resultierenden Anregungen.

Nicht vergessen will ich Dawei, Jaime, Mathias, Tilman und Tobias, die immer für ein gutes Arbeitsklima gesorgt haben und für lustige BBQs während meines Aufenthalts in Riverside zuständig waren.

Danken möchte ich des weiteren Marie Meister vom CNRS in Strasburg, Frankreich, bei der ich die Techniken der Blutzell- und Lymphdrüsenpräparation lernen durfte und bei Istvan Ando vom SZBK in Szeged, Ungarn, für die Bereitstellung des Blutzell-spezifischen Antikörpers.

Besondere Erwähnung verdient an dieser Stelle meine Frau Heike, die meine Entscheidungen immer respektiert und unterstützt hat, obwohl ich sehr gut weiß, wie überaus schwer ihr dies in manchen Situationen gefallen ist. Auf ihre Unterstützung konnte und kann ich mich in Zukunft stets verlassen. Ich hoffe, auch ein einfaches Dankeschön kann beschreiben, wieviel sie zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.

Zusammenfassung Zusammenfassung Signaltransduktionskaskaden ermöglichen es Zellen, auf extrazelluläre Signale mit einer zellulären Antwort zu reagieren. Diese Signalwege sind von fundamentaler Bedeutung für Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse. Signaltransduktionskaskaden werden durch die Bindung von kleinen chemischen Molekülen, den Liganden, an membrangebundene oder zytoplasmatische Rezeptoren aktiviert. Diese selektive Bindung von Liganden an Rezeptoren löst zytoplasmatische Enzymkaskaden aus, in deren Verlauf empfangene Signale in Form von posttranslationalen Modifizierungen von Proteinen weitergeleitet und letztendlich auf ein Effektormolekül übertragen werden.

Ein wichtiges Zellkommunikationssystem ist der Jak/Stat-Signaltransduktionsweg, der sich aus Rezeptoren der Cytokin-Rezeptor Familie, Rezeptor-assoziierten Tyrosin-spezifischen JanusKinasen (Jaks) und Transkriptionsfaktoren, den „Signal transducers and activators of transcription“ (Stats) zusammensetzt. Jaks nehmen eine zentrale Stellung in diesem System ein: zum einen interagieren sie direkt mit membrangebundenen Rezeptoren, zum anderen interagieren sie mit Stats und regulieren durch Phosphorylierung die transkriptionelle Aktivität dieser Faktoren.

Genetische und Zellkultur-Untersuchungen gaben Anlass zur Vermutung, dass Jaks nicht nur mit Stats sondern auch mit anderen Faktoren kommunizieren, um bestimmte zelluläre Prozesse, wie z.B. die Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Zellen in Drosophila melanogaster, zu steuern. Diese alternativen Zielfaktoren der Jaks waren zu Beginn dieser Arbeit nahezu unbekannt.

Zur Identifizierung bisher unbekannter Interaktionspartner der Drosophila Janus-Kinase Hopscotch (Hop) wurde ein „Yeast Two Hybrid Screen“ (YTHS) gewählt. Der YTHS weist Protein-Protein-Interaktionen durch Rekonstitution eines Transkriptionsfaktors nach und ermöglichst es, Interaktionspartner eines definierten Proteins in Proteinexpressionsbibliotheken zu identifizieren. Mit Hilfe des YTHS konnten im Rahmen dieser Arbeit 21 potentielle neue Interaktionspartner von Hop nachgewiesen werden. Drei dieser Interaktionspartner wurden im Zusammenhang mit Hop weiterführend charakterisiert.

Es konnte gezeigt werden, dass die identifizierte Drosophila Cyclin-abhängige Kinase Cdc2 mit Hop sowohl in vivo als auch in vitro interagiert. Ferner wurde belegt, dass Hop Cdc2 in vitro posttranslational durch Phosphorylierung modifizieren kann. Weiterführende in vivo Studien der temperatur-sensitiven konstitutiv aktiven hop-Mutante hopTum-l, die eine Überproliferation und vorzeitige Differenzierung der Drosophila Hämozyten bewirkt, haben ergeben, dass cdc2Mutanten diesen Blutzell-Phänotyp supprimieren. In doppelt heterozygoten hopTum-l/cdc2Mutanten ist die Anzahl der Hämozyten reduziert und die Differenzierung der Lamellozyten kann teilweise unterdrückt werden. Equivalent dazu wird die Hypertropie der hopTum-l-mutanten Lymphdrüse, dem hämatopoetischen Organ der Drosophila Larve, ebenfalls eingedämmt.

Für die Interaktionspartner CG2944 und CG17033 wurden die Interaktionen mit Hop in vivo und in vitro nachgewiesen. CG2944 ist ein Protein der SOCS-Familie, das durch Bindung an Hop die Aktivität der Janus-Kinase inhibieren könnte, wie es für humane SOCS-Proteine bereits gezeigt wurde. CG17033 ist ein Protein der TRAF-Familie. TRAFs sind Komponenten von Tumor-Nekrose-Faktor- oder Toll-Rezeptor Signaltransduktionskaskaden, welche die Aktivität von Transkriptionsfaktoren, z.B. humanem NF B und Drosophila Dorsal steuern.





Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein Zusammenspiel der Drosophila melanogaster Janus-Kinase Hop mit dem Zellzyklusregulator Cdc2 die Proliferation und Differenzierung der Hämozyten steuert. Sie zeigen ferner eine funktionelle direkte Regulation des Zellzyklus durch die Jak/Stat-Signaltransduktionskaskade, wobei erstmals der direkte aktivierende Einfluss von Hop auf eine Komponente des Zellzyklus nachgewiesen wird.

Summary Summary Signal transduction pathways are indispensable for developmental and differential processes, allowing cells to react to extra-cellular signals and return a cellular response. Signal transduction cascades are activated through the binding of small molecules, called ligands, to membrane-bound or cytoplasmatic receptors. The selective binding of ligands to receptors triggers cytoplasmatic enzyme cascades. Received signals are transmitted to proteins through post-translational modifications and finally carried to an effector molecule.

An important cell communication system is the Jak/Stat signal transduction pathway. It is composed of a receptor of the Cytokine-receptor family, receptor-associated tyrosine-specific Janus kinases (Jaks) and „Signal transducers and activators of transcription“ (Stats) transcription factors. Jaks play a central role in this system, by directly interacting with membrane-bound receptors. In addition they interact with Stats, regulating the transcriptional activity of Stats by phosphorylation. Genetic investigations and cell culture experiments gave reasons to speculate that Jaks not only communicate with Stats but also with other factors to regulate certain cellular processes such as the proliferation and differentiation of hematopoietic cells in Drosophila melanogaster. These alternative target factors of the Jaks were nearly undiscovered at the beginning of this work.

A „Yeast Two Hybrid Screen“ (YTHS) was chosen to identify as yet unknown interaction partners of the Drosophila Janus kinase Hopscotch (Hop). The YTHS detects protein-protein interactions via the reconstitution of transcription factors. It offers a powerful tool to explore interaction partners of a defined protein using protein expression libraries. In the course of this work it was possible to detect, with the aid of the YTHS, 21 potential new interaction partners of Hop. Three of these interaction partners were further characterized in connection with Hop.

One of the proteins identified was the Drosophila cyclin-dependent kinase Cdc2. It could be shown that Cdc2 interacts with Hop in vivo and in vitro. Moreover in vitro studies proved that Cdc2 can be post-translational phosphorylated by Hop. Using the temperature-sensitive hopTum-l mutant, a constitutively active hop-mutant that shows an over-proliferation and premature differentiation of the Drosophila hemocytes, studies show that cdc2-mutants can suppress the blood cell phenotype. In double heterozygous hopTum-l/cdc2-mutants, the number of hemocytes are reduced and the differentiation of the lamellocytes could partially be suppressed. The hypertrophy of the hopTum-l-mutant lymph gland, which is the hematopoietic organ in the Drosophila larvae, is equally reduced.

Interactions with Hop in vivo and in vitro were also shown for the new interaction partners CG2944 and CG17033. CG2944, a member of the family of SOCS-proteins, could inhibit the activity of Jaks through direct binding, as was already proved for human SOCS-proteins.

CG17033 is a protein of the TRAF family, which are components of the tumor-necrosis-factor or Toll-receptor signal transduction pathway. These proteins control the activity of transcription factors like human NF B or Drosophila Dorsal.

The results of this work show that an interplay of the Drosophila melanogaster Janus kinase Hop with the cell cycle regulator Cdc2 regulates the proliferation and differentiation of hemocytes. Furthermore, Hop was shown to directly influence the activation of a cell cycle component for the first time. Overall, this work shows a functional direct regulation of the cell cycle by the Jak/Stat signal transduction pathway.

Inhaltsverzeichnis

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