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«Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Fakultät Naturwissenschaften Universität Hohenheim Institut ...»

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Funktion N- und C-terminaler Proteindomänen für

Assemblierung, subzelluläre Lokalisation und

Physiologie der TRP-Ionenkanäle in

Drosophila Photorezeptoren

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Fakultät Naturwissenschaften

Universität Hohenheim

Institut für Physiologie

Fachgebiet Biosensorik

vorgelegt von:

Diplom Biologin Tina Oberacker

aus Bruchsal

Dekan: Prof. Dr. Heinz Breer

1. berichtende Person: Prof. Dr. Armin Huber

2. berichtende Person: Prof. Dr. Ralf Kölling eingereicht am: 10.Januar 2011 mündliche Prüfung am: 31. März 2011 Die vorliegende Arbeit 14. März 2011 von der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften“ angenommen.

VERÖFFENTLICHUNGEN

Ein Teil der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist an den folgenden Stellen veröffentlicht

worden:

Kongressbeiträge Richter, D., Oberacker, T., Kern, J., and Huber, A. (2007). Subunit composition of Drosophila microvillar TRPC channels: New answers to an old question. Göttingen Meeting of the German Neuroscience Society.

Oberacker, T., Richter, D., and Huber, A. (2007). N und C-terminal domains determine subcellular localization of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. 20. European Drosophila Research Conference (EDRC).

Oberacker, T., Richter, D., Cerny, A., and Huber, A. (2011). Localization of chimeric TRP/TRPL ion channels in Drosophila photoreceptors. 9th Göttingen Meeting of the German Neurosience Society.

„Wer kämpft, kann verlieren, wer nicht kämpft, hat schon verloren.“ Bertolt Brecht Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben:

Ich danke Herrn Prof. Dr. Armin Huber für die Vergabe des Themas dieser Dissertation, das Bereitstellen des Arbeitsplatzes und die konstruktiven Anregungen sowie die zahlreichen wissenschaftlichen Diskussionen.

Bei Herrn Prof. Dr. Ralf Kölling bedanke ich mich für bereitwillige die Übernahme des Korreferates.

Ein besonderer Dank geht an David Richter für die Herstellung der ersten Chimären und seiner Hilfe beim Start meiner Doktorarbeit.

Meiner Co-Doktorandin in Freud und Leid, Claudia Oberegelsbacher, möchte ich hier für das angenehme Arbeitsklima und die zahlreichen Aufheiterungen im grauen Laboralltag danken.

Zusammen haben wir des Öfteren gelacht, auch wenn es mal wieder nicht so lief, wie geplant.

Mein Dank gilt allen Mitarbeitern des Institutes sowie des Life Science Centers für die angenehme Atmosphäre, deren Hilfsbereitschaft in allen Belangen, für die Geduld mit mir und die Unterstützung im Laboralltag.

Herzlichen Dank an Berit J. sowie an meinen ehemaligen Kollegen Thomas, die immer ein offenes Ohr für mich hatten und mich immer wieder motiviert haben.

Bei Thomas und Berit Würtz bedanke ich mich recht herzlich für das Korrekturlesen der Arbeit.

Bedanken möchte ich mich bei Olaf und besonders bei Stefan, die mir die Elektrophysiologie-Messungen mit einer Engelsgeduld nähergebracht haben.

Bei Alexander möchte ich mich ganz herzlich für zahlreiche interessante, wissenschaftliche Unterhaltungen und Diskussionen sowie für die wertvollen Tipps bedanken. Ebenso für das kritische Betrachten des Manuskripts dieser Arbeit.

Ein herzliches Dankeschön auch an Beate für die netten Unterhaltungen am frühen Morgen auf dem Weg zur Arbeit.

Stefanie Eberhart danke ich recht herzlich für das Korrekturlesen des Summary.

Ganz besonders möchte ich mich an dieser Stelle bei meinen Eltern bedanken, ohne deren Hilfe und Unterstützung es mir nicht möglich gewesen wäre, dieses Ziel zu erreichen. Ein großer Dank geht auch an meine Schwester, die mir oft eine moralische Stütze war.

Meinen Freunden danke ich fürs geduldige Zuhören, für die vielen aufbauenden Worte, Mails und Telefonate besonders während der Zeit des Zusammenschreibens.

in Dankbarkeit, meinen Eltern

INHALTSVERZEICHNIS

I. Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung

2. Summary

3. Einleitung

3.1 Aufbau des Komplexauges von Drosophila melanogaster

3.2 Die Phototransduktionskaskade von Drosophila melanogaster

3.3 Funktionen und strukturelle Merkmale der TRP-Kanäle

3.4 Die durch Licht aktivierten Ionenkanäle TRP und TRPL von Drosophila............12 3.5 Reizabhängige Translokation des TRPL-Kanals

3.6 TRP-Kanalmultimere in den Photorezeptoren von Drosophila melanogaster.....15 3.7 Fragestellung

4. Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Chemikalien und sonstige Materialien

4.1.2 Häufig verwendete Puffer und Lösungen

4.1.3 Nukleinsäuren

4.1.3.1 Bakterien, Vektoren und Konstrukte

4.1.3.2 Oligonukleotide für PCR, RT-PCR und Sequenzierung

4.1.4 Antikörper

4.1.5 Versuchstiere

4.1.5.1 Drosophila melanogaster

4.1.6 Soft- und Hardware, spezielle Geräte

4.1.7 Öffentliche Internetquellen

4.2 Methoden

4.2.1 Molekularbiologische Methoden





4.2.1.1 Isolierung von Nukleinsäuren: Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli...........32 4.2.1.2 Reinigung von PCR-Produkten bzw. Gelbanden oder RNA

4.2.1.3 PCR

4.2.1.4 Sequenzierung

4.2.1.5 Verdau von doppelsträngiger DNA durch Restriktionsenzyme (Restriktionsverdau)

4.2.1.6 Auftrennung von DNA-Fragmenten durch Agarose-Gelelektrophorese..............34 4.2.1.7 DNA-Ligation

Gateway®-Klonierung

4.2.1.8 4.2.1.9 Isolierung von RNA aus Drosophila-Köpfen

4.2.1.10 RT-PCR

4.2.2 Herstellung transgener Fliegen

4.2.2.1 Herstellung der Injektionslösung

I

INHALTSVERZEICHNIS

4.2.2.2 Injektion des Konstrukts in Drosophila-Embryonen

4.2.3 Aufzucht und Haltung von Fliegen

4.2.4 Belichtung von Fliegen

4.2.5 Präparation des biologischen Materials

4.2.5.1 Präparation von Drosophila-Köpfen

4.2.5.2 Präparation der Fliegen für Immuncytochemie

4.2.5.3 Präparation von Protein-Gesamtextrakten aus Drosophila-Köpfen

4.2.5.4 Präparation von Proteinextrakten für Co-Immunopräzipitation

4.2.6 Biochemische Methoden

4.2.6.1 Immunopräzipitation aus Drosophila-Proteinextrakten

4.2.7 SDS-PAGE: Natrium-Dodecylsulfat-Gelelektrophorese

4.2.7.1 Western-Blot und immunologischer Nachweis der Proteine

4.2.8 „Strippen“ von Membranen für weitere immunologische Nachweise

4.2.9 Immuncytochemie und Fluoreszenzmikroskopie

4.2.9.1 Anfertigung von Cryoschnitten für die Immuncytochemie

4.2.9.2 Durchführung der Immunmarkierung der Cryoschnitte

4.2.9.3 Wasserimmersionsmikroskopie

4.2.9.4 Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen

4.2.9.5 Beobachtung der tiefen Pseudopupille

4.2.10 Elektroretinogramm (ERG)

4.2.11 Strategie für die Klonierung von TRP/TRPL-Chimären

4.2.11.1 Amplifikation der TRPL-TM-Bereiche für die Chimären

4.2.11.2 Herstellung von Chimäre 4-eGFP

4.2.11.3 Herstellung von Chimäre 5-eGFP

4.2.11.4 Herstellung von Chimäre 6-eGFP

5. Ergebnisse

Spezifität der Antikörper α-TRPL und α-TRP in Western Blot Analysen.............51 5.1 5.2 Transgene Expression chimärer TRP/TRPL-eGFP Fusionsproteine in den Photorezeptoren von Drosophila

5.3 Elektrophysiologische Untersuchungen der TRP/TRPL-eGFP Chimären...........55 5.3.1 Elektroretinogramme von Chimäre 1-eGFP-6-eGFP im wt-Hintergrund.............55 5.3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen der Chimären 1-6-eGFP in der trpl302-Nullmutante

5.3.3 Elektrophysiologische Untersuchungen der Chimären 1-6-eGFP in der trpP343-Nullmutante

5.3.4 Elektrophysiologische Untersuchungen der Chimären 1-4 und 6-eGFP in der trpl302; trpP343-Doppelnullmutante

5.4 Überprüfung der Expression von Rhodopsin-1 in den Photorezeptorzellen transgener Chimären 4- und 5-eGFP

II

INHALTSVERZEICHNIS

5.4.1 Nachweis der Genexpression von ninaE in den Chimären 4-eGFP und Chimäre 5-eGFP (2nd) mittels RT-PCR

5.5 Mikroskopische Untersuchung der Translokation chimärer TRP/TRPL-eGFP Fusionsproteine

5.6 Lichtabhängige Translokation von Chimäre 3-eGFP im Vergleich zu TRPL-eGFP

5.6.1 Zeitverlauf der Translokation von Chimäre 3-eGFP im Vergleich zu TRPL-eGFP

5.6.2 Lokalisation der Chimären 1-6-eGFP in Mutanten-Hintergründen

Lokalisation der Chimären 1-6-eGFP in der trpP343-Mutante

5.6.3 5.7 Multimerisierung von TRP und TRPL-Kanälen in den Photorezeptorzellen von Drosophila

5.7.1 Homomultimerisierung von TRP und TRPL

5.7.2 Einfluss der N- und C-Termini von TRPL bzw. TRP auf die Assemblierung der Kanaluntereinheiten

5.7.2.1 Co-IP mit den Chimären 1-3-eGFP

5.7.2.2 Co-IPs mit den Chimäre 4-6-eGFP

5.7.2.3 Co-IPs mit Chimären 1-3-eGFP sowie Chimäre 5- und 6-eGFP im trpl302-Mutanten-Hintergrund

Co-IPs mit Chimären 1-, 2-, 4-6-eGFP im trpP343-Mutanten-Hintergrund.............96 5.7.2.4 5.8 Lokalisation endogener Kanäle bei gleichzeitiger Expression der Chimären 1-6-eGFP

Spezifität der Antikörper α-TRPL und α-TRP in der Immuncytochemie..............98 5.8.1 Erkennung der Chimären durch α-TRPL bzw. α-TRP Antikörper in der 5.8.2 Immuncytochemie

5.8.3 Beeinflussung der subzellulären Lokalisation von endogenem TRPL durch die Chimären 1-6-eGFP

5.8.4 Beeinflussung der subzellulären Lokalisation von endogenem TRP durch die Chimären 1-6-eGFP

6. Diskussion

6.1 Elektrophysiologie

6.2 Multimerisierung von TRP-Kanälen

6.2.1 Bedeutung der Multimerisierung von Ionenkanälen

6.2.2 Multimerisierung von TRP und TRPL in Drosophila-Photorezeptoren..............115 6.2.3 In vivo Homomultimerbildung wird via cytosolische Termini kontrolliert............117 6.3 Subzelluläre Lokalisation von TRP-Kanälen

6.3.1 Subzelluläre Veränderung der Lokalisation von Membranproteinen.................121 6.3.2 Einfluss cytosolischer Termini auf die Translokation des TRPL-Kanals............123 6.4 Interferenz der Chimären 4- und 5-eGFP mit dem Rhodopsin-1 Transport.......125 7. Literaturverzeichnis

8. Abkürzungen

9. Anhang

III

INHALTSVERZEICHNIS

9.1 Multiples Alignment für Stammbaum der Drosophila TRP-Kanäle

9.2 Vektorkarten der Keimbahntransformationsvektoren der Chimären 4-6-eGFP.152

9.3 Vektorkarten der S2-Zellkulturvektoren der Chimären 4-6-eGFP

9.4 Untersuchung der grün fluoreszierenden tiefen Pseudopupille der Chimären 4-6-eGFP

9.5 Untersuchung der tiefen Pseudopupille von Chimäre 4-6-eGFP in den trpl302-, trpP343-Einzel- sowie in der Doppel-Nullmutante

9.6 cDNA-Sequenzen von ninaE und rp49

9.6.1 cDNA-Sequenz ninaE

9.6.2 cDNA-Sequenz rp49

9.7 Quantifizierung der relativen eGFP-Fluoreszenz in den Rhabdomeren............161

9.8 Beeinflussung der subzellulären Lokalisation von endogenem TRPL durch TRPL-eGFP bzw. endogenem TRP durch TRP-eGFP

9.9 Beeinflussung der subzellulären Lokalisation von endogenem TRP durch die Chimären 1-6-eGFP in der trpl302-Nullmutante

9.10 Beeinflussung der subzellulären Lokalisation von endogenem TRPL durch die Chimären 1-6-eGFP in der trpP343-Nullmutante

10. Eidesstattliche Erklärung

IV ZUSAMMENFASSUNG

1. Zusammenfassung In den Photorezeptorzellen von Drosophila melanogaster sind die Kationen-Kanäle TRP und TRPL für die Erzeugung des Rezeptorpotentials verantwortlich. Es ist bekannt, dass der TRPL-Ionenkanal lichtabhängig seine subzelluläre Lokalisation verändert, während TRP sowohl in dunkel- als auch in hell-adaptierten Augen im Rhabdomer lokalisiert ist. Des Weiteren gilt als gesichert, dass diese Ionenkanäle als Tetramere vorliegen. In der wissenschaftlichen Literatur wird jedoch kontrovers diskutiert, ob TRP und TRPL nur als Homomultimere oder auch als Heteromultimere auftreten.

In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Co-Immunopräzipitationen (Co-IPs) von unmarkierten TRP- oder TRPL-Kanälen gezeigt, dass die tetrameren Kanäle in den Photorezeptoren von Drosophila ausschließlich aus Homomultimeren bestehen. Co-IPs von eGFPmarkierten TRP- oder TRPL-Kanälen zeigten, dass sich die Tetramere aus eGFP-markierten und den entsprechenden endogenen Kanaluntereinheiten zusammensetzen.

Um die biochemischen und physiologischen Eigenschaften der cytosolischen N- und CTermini von TRP und TRPL untersuchen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit eGFP-markierte chimäre TRP/TRPL-Ionenkanäle konstruiert und in den Photorezeptorzellen R1-R6 von Drosophila exprimiert. Speziell wurde die Auswirkung dieser Termini auf die Translokation der Ionenkanäle zwischen Rhabdomer und Zellkörper sowie auf die Assemblierung der Tetramere untersucht.

Untersuchungen zur Translokation eGFP-markierter Chimären zeigten, dass die Chimäre mit den TRP-Transmembranbereichen und TRPL N- sowie C-Termini eine TRPL-typische, jedoch zeitlich schnellere, Translokation durchführt. Der Austausch von einem der beiden TRPL-Termini gegen TRP bewirkte, dass die Chimären vorwiegend im Zellkörper lokalisiert waren. Diese Lokalisation entspricht weder der Translokation von TRPL noch der rhabdomerischen Lokalisation von TRP. Sequenzmotive, die die subzelluläre Lokalisation der Drosophila TRP-Kanäle bestimmen, sind daher offenbar sowohl im N- als auch im CTerminus von TRPL lokalisiert und nur im Zusammenspiel beider Termini wirksam.

Co-IPs dieser eGFP-markierten Chimären zeigten, dass für eine Interaktion mit dem TRPLKanal der C-Terminus von TRPL wichtiger zu sein scheint als der N-Terminus. Für die Interaktion mit dem TRP-Kanal scheint ebenfalls der C-Terminus von TRP wichtiger zu sein als der N-Terminus. Für beide Fälle konnte in einer Chimäre aber auch eine Co-IP von TRPL bzw. TRP über den N-Terminus beobachtet werden. Im Gegensatz zu den Termini werden die Transmembranbereiche beider Kanäle für eine Interaktion nicht benötigt.



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