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«Gábor Gondi München 2013 Einfluss eines Carboanhydrase XII-spezifischen Antikörpers auf das Tumorwachstum in vitro und in vivo sowie ...»

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Einfluss eines Carboanhydrase XII-spezifischen Antikörpers auf das Tumorwachstum in vitro und in vivo sowie

Onkosomen-basierte Generierung neuer tumorreaktiver

Antikörper

Gábor Gondi

München 2013

Einfluss eines Carboanhydrase XII-spezifischen Antikörpers auf das Tumorwachstum in vitro und in vivo sowie

Onkosomen-basierte Generierung neuer tumorreaktiver

Antikörper

Gábor Gondi

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

an der Fakultät für Biologie

der Ludwig-Maximilians-Universität München vorgelegt von Gábor Gondi aus Kiskunfélegyháza in Ungarn angefertigt am Helmholtz Zentrum für Gesundheit und Umwelt München, den 27.05.13 Erstgutachter: PD. Dr. Josef Mautner Zweitgutachter: Prof. Dr. Angelika Böttger Tag der mündlichen Prüfung: 14.10.2013 Eidesstattliche Erklärung Ich versichere hiermit ehrenwörtlich, dass die vorgelegte Dissertation von mir selbstständig und nur unter der Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel ohne unerlaubte Hilfe angefertigt worden ist.

München, Mai 2013

(Gábor Gondi) Inhaltsverzeichnis 6

INHALTSVERZEICHNIS

1   EINLEITUNG

  1.1   Krebs in Deutschland

  1.2   Evolutionäre Dynamik der Karzinogenese

  1.2.1   Klonale Evolution und Ökosystem Krebs

  1.2.2   Azidose und Überlebensvorteil durch membranständige Carboanhydrasen.... 14   1.2.3   Wichtige Komponenten der Tumor-assoziierten pH-Regulation

  1.2.4   Die Rolle der Tumor-assoziierte Carboanhydrasen IX und XII

  1.2.4.1   Carboanhydrase IX

  1.2.4.2   Carboanhydrase XII

  1.3   Tumorexosomen: Eine Klasse von Mikrovesikeln

  1.4   Bedeutung monoklonaler Antikörper für die klinische Onkologie............... 24   1.5   Ziele dieser Arbeit

  2   MATERIAL UND METHODEN

  2.1   Material

  2.1.1   Geräte

  2.1.2   Verbrauchsmaterialien

  2.1.3   Chemikalien

  2.1.4   Zelllinien

  2.1.5   Verwendeter Mausstamm

  2.1.6   Primäre Antikörper und Sekundärkonjugate

  2.1.7   Plasmide

  2.1.8   Oligonukleotide

  2.1.8.1   Primer für Klonierung der CA IX

  2.1.8.2   Primer für Real-time-PCR

  2.1.9   Dienstleistungen

  2.1.10   Software (Computer-Programme)

  2.1.11   Puffer und Lösungen

  2.2   Methoden

  2.2.1   Molekularbiologische Methoden

  2.2.1.1   Bakterienkultur

  2.2.1.2   Klonierung und Restriktionsenzymverdau

  2.2.1.3   Isolierung von zellulärer RNA

  2.2.1.4   Quantitative Real-time RT-PCR

  2.2.2   Zellkultur

  2.2.2.1   Zellkulturbedingungen

  2.2.2.2   Kryokonservierung von Zellen

  Inhaltsverzeichnis 7 2.2.2.3   Isolation von Onkosomen aus Zellkulturüberständen

  2.2.2.4   Biotinylierung von Zellen

  2.2.2.5   Transfektion, Selektion und Expansion hCA IX-exprimierender Zellen

  2.2.2.6   Mycoplasmentest

  2.2.2.7   MTT-Test von 2D-Kulturen

  2.2.2.8   Sphäroid-Kulturen

  2.2.3   Proteinbiochemische Methoden

  2.2.3.1   Proteinextraktion aus Säugerzellen

  2.2.3.2   Bestimmung der Proteinkonzentration mit BCA-Assay

  2.2.3.3   Anreicherung von Membranfraktionen

  2.2.3.4   Immunpräzipitation und Massenspektrometrie

  2.2.3.5   SDS-Gelelektrophorese

  2.2.3.6   Färbungen von Polyacrylamid-Gelen

  2.2.3.7   Westernblot

  2.2.3.8   Dot-Blot

  2.2.3.9   Kopplung von Antikörpern mit Fluorochromen

  2.2.4   Immunbiologische Methoden

  2.2.4.1   Durchflusszytometrie

  2.2.5   Tierversuchskundliche Methoden

  2.2.5.1   Transplantation von Tumorzellen

  2.2.5.2   Injektion der Therapie- und Kontrollantikörper

  2.2.5.3   Biolumineszenz-basierte Bildgebung

  2.2.5.4   Immunisierung von Ratten

  2.2.5.5   Herstellung von Hybridom-Klonen

  2.2.6   Statistik

  3   ERGEBNISSE

 

3.1 Einfluss des 6A10-Antikörpers auf das Tumorwachstum in vitro

  3.1.1   Verlangsamtes Wachstum kultivierter Tumorzellen bei Blockierung der CA XII und CA IX

  3.1.2   Reduziertes Wachstum kultivierter Tumorzellen bei Blockierung der CA XII und CA IX im Sphäroid-Modell

  3.1.3   Eine Real-Time-PCR-Analyse zeigt Herunterregulation von NBC2 als Antwort auf 6A10-Behandlung von Sphäroiden

  3.2   Einfluss des 6A10-Antikörpers auf das Tumorwachstum in vivo................. 67   3.2.1   Etablierung solider Tumoren in NSG-Mäusen

  3.2.2   Erster Tierversuch mit A549-Zellen zur Dosisfindung zeigt Behandlungserfolg durch regelmäßige Applikation des 6A10-Antikörpers

  3.2.3   Tierversuch mit U87-Zellen zur Dosisfindung zeigte keinen Behandlungserfolg durch regelmäßige Applikation des 6A10-Antikörpers

  Inhaltsverzeichnis 8 3.2.4   Der Einsatz von A549-Zellen aus einer Einzellzellklonierung führt zu besonders starker 6A10-bedingter Wachstumsverzögerung

  3.2.5   Die Kolokalisation der Signale zweier verschiedener optischer Bildgebungsverfahren verifiziert die Bindung des 6A10 an Tumorgewebe....... 84   3.2.6   Mithilfe von ex-vivo-Analysen konnten makroskopisch unauffällige Organe hochauflösend auf Metastasen untersucht werden





  3.3   Gewinnung und Charakterisierung Tumor-gerichteter monoklonaler Antikörper

  3.3.1   Screening und Auswahl geeigneter Hybridome mithilfe der reversen Immunisierungs-Methode

  3.3.1.1   Identifizierung und Bestätigung Tumor-reaktiver Antikörper

  3.3.1.2   Der Antikörper 13C8 erkennt das Antigen MelCAM (CD146)

  3.3.1.3   Der Antikörper 8F2 erkennt das Antigen Integrin α3

  3.3.1.4   Der Antikörper 2A4 erkennt wahrscheinlich das Protein Integrin αV

  3.3.1.5   Der Antikörper 3A10 erkennt wahrscheinlich das Protein Integrin β3

  3.3.1.6   Der Antikörper 12E12 erkennt das Antigen Protein 14-3-3 zeta/delta

  3.3.1.7   Der Antikörper 23E12 erkennt das Antigen Hsp90

  3.3.2   Generierung von vier Carboanhydrase IX-spezifischen Antikörpern mit der zielgerichteten Immunisierungs-Methode

  4   DISKUSSION

  4.1   Carboanhydrasen, Mikroumgebung und evolutionäre Medizin................. 105   4.2   Die in vivo-Inhibierung der Carboanhydrase XII bietet Möglichkeiten, neue bildgebende Verfahren mit Therapieformen durch konjugierte Antikörper zu kombinieren

  4.3   Zwei auf Onkosomen-basierte Immunisierungs-Methoden zur Generierung neuer Tumor-reaktiver monoklonaler Antikörper

  5   ZUSAMMENFASSUNG

  SUMMARY

  6   ANHANG

  7   LITERATURVERZEICHNIS

  8   ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

  9   LEBENSLAUF

 

–  –  –

Jedes Jahr erkranken in Deutschland rund 460.000 Männer und Frauen mit einem durchschnittlichen Alter von 69 Jahren an Krebs. Jeder zweite Mann und fast jede zweite Frau muss damit rechnen, im Laufe des Lebens an Krebs zu erkranken (RobertKoch-Institut et al. 2012); ähnliche Zahlen gelten für alle industrialisierten Länder (Siegel et al. 2012). Damit ist Krebs eine der häufigsten Todesursachen, wobei die meisten Patienten an den Folgen der Metastasen, seltener am Primärtumor sterben (Klein 2009, Stock and Schwab 2009, Loeb 2011). Die meisten Krebserkrankungen sind epithelialen Ursprungs, also Karzinome. Dabei handelt es sich wiederum in 70% der Fälle um Adenokarzinome, der Rest sind Plattenepithelkarzinome und kleinzellige Karzinome, wie z.B. der Lunge. Neben den genannten Karzinomen kommen auch Melanome, Leukämien und Lymphome im Bereich von jeweils etwa 3% relativ häufig vor (Abb 1.1). Seltenere Krebsformen gehen beispielsweise vom Bindegewebe aus, wie Mesotheliome und verschiedene Sarkome, oder haben einen neurologischen Ursprung. Wie Abbildung 1.1B zeigt, sind deshalb die Karzinome die häufigsten krebsbedingten Todesursachen (Robert-Koch-Institut et al. 2012).

Von 1980 bis 2006 hat in Deutschland die Zahl der jährlich neu aufgetretenen Krebserkrankungen bei Frauen um 35 %, bei Männern um mehr als 80 % zugenommen. Diese hohe Zahl kommt hauptsächlich durch das zunehmende Durchschnittsalter der Bevölkerung in Deutschland zustande. Betrachtet man die altersstandardisierten Werte insbesondere jüngerer Jahrgänge, ergeben sich seit 1999 abnehmende krebsbedingte Sterberaten bei beiden Geschlechtern (Robert-Koch-Institut et al. 2012). Dennoch ist die klinische Prognose für Karzinompatienten nach wie vor nicht zufriedenstellend, so dass die Suche nach besseren Therapien einen hohen wissenschaftlichen und gesellschaftlichen Stellenwert besitzt.

Einleitung 10 Abb 1.1 Krebs in Deutschland (A) Die häufigsten Krebserkrankungen und (B) die häufigsten krebsbedingten Sterbefälle (jeweils in Prozent aller Krebserkrankungen bzw. krebsbedingten Sterbefälle) in Deutschland.

Übernommen aus Krebs in Deutschland 2007/2008 (Robert-Koch-Institut, 2012).

Einleitung 11 1.2 Evolutionäre Dynamik der Karzinogenese 1.2.1 Klonale Evolution und Ökosystem Krebs Krebs ist eine Erkrankung klonalen Ursprungs (Merlo et al. 2006). Jeder Tumor kann mit einem Ökosystem verglichen werden, das von physikalischen, physiologischen und metabolischen Faktoren beeinflusst wird. Dabei setzt sich das “Ökosystem Krebs” aus Tumorzellen, myo-epithelialen Zellen, Stromazellen, Tumor-assoziierten Fibroblasten und verschiedenen inflammatorischen Zellen wie Tumor-assoziierten Makrophagen zusammen (Pienta et al. 2008, Gillies et al. 2012). All diese Zellklassen bilden die lebendigen Komponenten dieses Ökosystems, die miteinander über lösliche und unlösliche Faktoren interagieren. Unlösliche Faktoren sind z.B. die Proteine der extrazellulären Matrix, lösliche sind unter anderen Sauerstoff, Metaboliten, Hormone, Chemokine und Cytokine. Gillies und Kollegen führten dazu eine treffende Metapher an, nach der man sich Tumoren als Kontinente vorstellen kann, die durch multiple zelluläre Spezies bevölkert werden, welche sich an regionale Variationen der selektiven Umwelteinflüsse anpassen (Gillies et al. 2012). Nowell und Cairns postulierten Mitte der siebziger Jahre des vergangenen Jahrhunderts, dass genomische Instabilität, welche mit der Generation und Selektion von Mutationen einhergeht, zu einer schrittweisen Karzinogenese beiträgt. Sie äußerten damit als Erste die Idee, dass Krebs auf somatischer Evolution beruht (Cairns 1975, Nowell 1976, Loeb 2011). Jahrzehnte später wurde allgemein akzeptiert, dass die Entstehung von Krebs als ein der Darwinschen Evolutionstheorie folgender Prozess beschrieben werden kann (Loeb 2011). Die Vererbbarkeit von Variationen, die den Erfolg der Reproduktion betreffen, sind im Prinzip in einer Population notwendig und ausreichend für die natürliche Auslese (Franklin and Lewontin 1970).

Gerlinger und Swanton formulierten 40 Jahre später drei evolutionäre Grundprinzipien, nach denen die natürliche Selektion im Sinne der sogenannten somatischen Evolution stattfinden kann. Erstens müssen individuelle Variationen in der Population vorkommen, welche zweitens vererbbar sein müssen. Das dritte Prinzip ist die logische Folge daraus, nämlich dass Variationen zwischen Individuen zu differenziellem Überleben und Reproduktionserfolg (Fitness) führen (Gerlinger and Swanton 2010).

Im Falle von Krebs sind diese Variationen im Wesentlichen auf genetische Instabilität zurückzuführen, ohne die sich die Mutationsrate von normalen Zellen und Tumorzellen kaum unterscheidet (Jones et al. 2008). Sind einzelne Tumorzellpopulationen mit gleichem genetischen Ursprung weit voneinander entfernt im Gewebe verteilt, ist die Wahrscheinlichkeit einer divergenten Evolution hoch und die Wahrscheinlichkeit, dass der Tumor durch eine einzige systemische Therapie zu behandeln ist, gering (Maley et al. 2004).

Einleitung 12 Das Konzept der klonalen Evolution beinhaltet, dass ein Zellklon durch Anreicherung von somatischen Mutationen die Fähigkeit erwirbt unkontrolliert zu proliferieren (Stratton et al. 2009). Zu diesen Mutationen zählen Substitutionen einzelner Basen, Insertionen und Deletionen, Translokationen, strukturelle Veränderungen, abnormale Kopienzahl der Chromosomen (Aneuploidie), sowie epigenetische Veränderungen, wie z.B. Modifikationen des Methylierungsmusters von Cytosinen und Histonen (Laird 2005). Diese Veränderungen werden unter den Begriffen genetische und chromosomale Instabilität zusammengefasst.

Einige dieser Mutationen sind bereits in den Keimbahnzellen präsent und damit in allen somatischen Zellen vorhanden. Zusammen mit neu erworbenen Mutationen durch exogene DNA-schädigende Einflüsse kann ein neoplastischer Klon entstehen, der erfolgreich eine ökologische Nische besetzt. Diese Gründer-Zelle proliferiert nun unkontrolliert, was man auch als klonale Expansion bezeichnet (Pienta et al. 2008). Dieser sogenannte Gründereffekt ist neben dem Flaschenhalseffekt einer der wichtigsten direkten Auswirkungen einer stringenten Selektion, beispielsweise durch sich genotoxisch auswirkende Azidose oder eine Chemotherapie. Häufig sind diese selektiven Umwelteinflüsse so stark, dass nur eine kleine Tumorzellpopulationen sie überlebt und den Flaschenhals überwindet. Beide Effekte sind in der Evolution sowohl ganzer Organismen als auch somatischer Populationen sehr häufig und führen dazu, dass wenige Tumorzellen ihr gesamtes genetisches Repertoire durchsetzen und an ihre Tochterzellen vererben, die folglich die Gesamtpopulation dominieren und die Evolution des nun weniger heterogenen Tumors in eine neue Richtung lenken.



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