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«Proteasen in pflanzlichen Organellen: Funktionelle Charakterisierung und Strukturanalyse der Cystein-Endopeptidase in Ricinosomen und Reinigung einer ...»

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Biologikum Weihenstephan

Lehrstuhl für Botanik

Technische Universität München

Proteasen in pflanzlichen Organellen: Funktionelle

Charakterisierung und Strukturanalyse der Cystein-Endopeptidase

in Ricinosomen und Reinigung einer Processing Peptidase aus

Glyoxysomen

Michael Helm

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät

Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt

der Technischen Universität München

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. Grill Prüfer der Dissertation: 1. Priv.-Doz. Dr. Chr. Gietl

2. Univ.-Prof. Dr. B. Hock

3. Univ.-Prof. Dr. G. Forkmann Die Dissertation wurde am 23.02.2006 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 10.05.2006 angenommen.

Don't waste your time harvesting low-hanging fruits!

Wolfram Bode

Teile der Arbeit wurden bereits veröffentlicht in:

Than, M. E., Helm, M., Simpson, D. J., Lottspeich, F., Huber, R. und Gietl, C. (2004) The

2.0 Å crystal structure and substrate specificity of the KDEL-tailed cysteine endopeptidase

functioning in programmed cell death of Ricinus communis endosperm. J. Mol. Biol. 336:

1103-1116. © 2004 Elsevier Science Ltd..

Greenwood, J. S., Helm, M. und Gietl, C. (2005) Ricinosomes and endosperm transfer cell structure in programmed cell death of the nucellus during Ricinus seed development. Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102: 2238-2243. © 2005 The National Academy of Sciences of the U.S.A.

Inhaltsverzeichnis Abkürzungen

1. Danksagung

2. Zusammenfassung

3. Einleitung

3.1 Protein-Umsatz

3.1.1 Chaperon-abhängige Proteinfaltung und Qualitätskontrolle

3.1.2 Proteinabbau

3.1.3 Das Ubiquitin-Proteasom-System

3.1.4 Cytosolische Proteolyse von Oligopeptiden

3.1.5 Lysosomale Proteolyse

3.2 Ricinosomen

3.3 Programmierter Zelltod

3.4 Peroxisomen und Glyoxysomen

3.4.1 Glyoxysomale Fettmobilisierung

3.4.2 Photorespiration der Blatt-Peroxisomen

3.4.3 Weitere Stoffwechselabläufe in Peroxisomen

3.4.4 Peroxisomales Targeting

3.5 Peroxisomale Peptidasen

3.5.1 Lon-Proteasen

3.5.2 Metallopeptidasen der Pitrilysin-Familie

3.5.3 Deg-Proteasen

3.6 Protein Processing oder limitierte Endoproteolyse

3.6.1 Proprotein-Convertasen

3.6.2 Processing Peptidasen

3.6.2.1 Mitochondriale Processing Peptidasen

3.6.2.2 Chloroplasten Stroma Processing Peptidase

3.7 Zielsetzung

4. Material und Methoden

4.1 Allgemeiner Teil

4.1.1 Anzucht von Versuchspflanzen

4.1.1.1 Ricinus communis

4.1.1.2 Arabidopsis thaliana

4.1.1.3 Citrullus vulgaris

4.1.2 Gewinnung von Proteinextrakten

4.1.2.1 Ricinus communis

4.1.2.2 Arabidopsis thaliana

4.1.3 Proteinbestimmung

4.1.4 Aufkonzentrieren von verdünnten Proteinlösungen

4.1.5 SDS-PAGE und Western-Blot

4.1.5.1 Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

4.1.5.2 Western-Blot

4.1.5.3 Coomassie-Färbung

4.1.5.4 Silberfärbung

4.1.5.5 Native “SDS-PAGE”

4.1.5.6 Aktivitätsgel-Assay

4.1.6 Herstellung und Kontrolle von anti-AtCep-Peptid-Antikörpern............. 71 4.1.7 Mikroskopie

4.1.7.1 Histologische GUS-Färbung

4.1.7.2 Einbettungen

4.1.7.3 Immunocytochemie

4.1.7.4 TUNEL-Assay

4.1.7.5 Transmissionselektronenmikroskopie

4.2 Spezieller Teil

4.2.1 Untersuchung der Substratspezifität sowie Reinigung der CysEP aus Ricinus communis für die Kristallographie

4.2.1.1 Ricinosomen-Isolierung

4.2.1.2 Untersuchung der Substrat- und Spaltspezifität der Ricinus CysEP durch β-Casein-Verdau

4.2.1.3 Bestimmung der Substratspezifität der Ricinus CysEP mittels fluoreszenzgequenchter Peptide

4.2.1.4 Reinigung der Ricinus CysEP über Säulenchromatographie.................. 85 4.2.1.5 Bestimmung der N- und C-terminalen Sequenz der inhibierten und gereinigten Ricinus CysEP

4.2.1.6 Kristallographische Methoden

4.2.1.7 Modellbau und Verfeinerung

4.2.1.8 Graphische Darstellungen und Sequenzvergleiche

4.2.2 Reinigung und Charakterisierung der Glyoxysomalen Processing Peptidase aus Citrullus vulgaris

4.2.2.1 Anreicherung von Glyoxysomen aus Kotyledonen von Citrullus vulgaris

4.2.2.2 Bestimmung der proteolytischen Aktivität

4.2.2.3 Aufbereitung der isolierten Glyoxysomen-Präparationen

4.2.2.4 Reinigung der Glyoxysomalen Processing Peptidase über Säulenchromatographie

4.2.2.5 Vorfraktionierung mittels präparativer nativer isoelektrischer Fokussierung im Sephadex-Flachbett

4.2.2.6 Zwei-Dimensionale Elektrophorese (2-D)

4.2.2.7 Versuche zur Charakterisierung der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15

5. Ergebnisse

5.1 Gewebsspezifische Expression der drei KDEL-Peptidasen in Arabidopsis thaliana

5.1.1 Histochemische Lokalisation der AtPCEP1, AtPCEP2 und AtPCEP3-Aktivität in transgenen Promotor-GUS-Linien





5.1.1.1 GUS-Expression unter der Kontrolle des AtCEP1-Promoters.............. 109 5.1.1.2 Expression unter der Kontrolle des AtCEP2-Promoters

5.1.1.3 GUS-Expression unter der Kontrolle des AtCEP3-Promoters.............. 120 5.1.2 Nachweis der drei KDEL-Peptidasen in Gewebeextakten von Arabidopsis thaliana durch spezifische Antikörper

5.2 Die Ricinus CysEP unterstützt auch in reifenden Samen den Zelltod kollabierender Gewebe

5.3 Die 2.0 Å Kristallstruktur und Substratspezifität der nativen CysEP aus Ricinosomen von Ricinus communis

5.3.1 Vorhersage der Spaltspezifität der Ricinus CysEP auf der Grundlage der Hydrolyse von synthetischen Peptiden

5.3.2 Analyse der Spaltmotive des proteolytischen β–Casein-Verdaus durch Ricinosomen-CysEP aus Ricinus communis

5.3.3 Reinigung der reifen Ricinus CysEP mit dem kovalent gebundenen Inhibitor H-D-Val-Leu-Lys-Chloromethylketon und die Bestimmung von N- und C-Terminus

5.3.4 Die Kristallstruktur und das aktive Zentrum

5.3.4.1 Kristallisation und Datensammlung

5.3.4.2 Kristallisation und Gesamtstruktur

5.3.4.3 Die Substratsbindungsfurche

5.3.4.4 Spezifitäts-Subdomänen

5.4 Die Reinigung und Charakterisierung der Glyoxysomalen Processing Peptidase aus dunkel gewachsenen Kotyledonen von Citrullus vulgaris

5.4.1 Reinigung der Glyoxysomalen Processing Peptidase über Säulenchromatographie

5.4.1.1 DEAE-Anionenaustausch-Chromatographie

5.4.1.2 Gelfiltrations-Chromatographie

5.4.1.3 Hydroxyapatit-Chromatographie

5.4.1.4 MonoQ-Anionenaustausch-Chromatographie

5.4.2 Im Durchlauf der Amicon-Ultrafiltration ist ein Aktivator nachweisbar

5.4.2.1 Beständigkeit des Aktivators

5.4.2.2 Die Korrelation von Fluoreszenz-Aktivitätsgel-Assay und Western-Blot mit anti-AtDeg15-Peptid-Antikörper identifiziert die Glyoxysomale Processing Peptidase als Deg15-Peptidase.............183 5.4.3 Reinigung der Glyoxysomalen Processing Peptidase über DEAE-Anionenaustausch-Chromatographie, präparative native Sephadex-IEF und 2-D-PAGE

5.4.3.1 Analyse des Reinigungsverlaufs der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15 mittels Gelatine-Aktivitätsgel................ 187 5.4.3.2 Durch die Korrelation von 2-D-Gel und 2-D-Western-Blot mit anti-AtDeg15-Peptid-Antikörper konnten Molekülmasse und pI der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15 bestimmt werden

5.4.4 Charakterisierung der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15......192

5.4.4.1 Die Untersuchung der Spaltspezifität der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15 mit synthetischen Peptiden erbrachte eine Spezifität für Substrate mit Cys an P1 oder P2..............192 5.4.4.2 Das pH-Optimum der proteolytischen Aktivität der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15 liegt im basischen Bereich

5.4.4.3 Phosphat-Puffer erhöhte die proteolytische Aktivität der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15

5.4.4.4 Das Temperatur-Optimum der proteolytischen Aktivität der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15 liegt bei 45°C............... 199 5.4.4.5 Einige ausgewählte Proteine zeigen einen aktivierenden Einfluß auf die proteolytische Aktivität der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15

5.4.4.6 Einige ausgewählte Cofaktoren zeigen keinen Einfluß auf die proteolytische Aktivität der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15

5.4.4.7 Der Einfluß von Inhibitoren auf die proteolytische Aktivität der Glyoxysomalen Processing Peptidase/Deg15

5.4.4.8 Die Glyoxysomale Processing Peptidase/Deg15 zeigt in-vitro bei 45°C starke proteolytische Aktivität gegenüber glyoxysomalen Matrix-Proteinen

5.4.4.9 Die Dimerisierung der Glyoxysomalen Processing Peptidase/ Deg15 ist von Ca2+-Ionen abhängig

6. Diskussion

6.1 Peptidasen mit C-terminalem KDEL

6.2 Peroxisomale Peptidasen

6.3 Ausblick

7. Referenzen

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Die vorliegende Arbeit wurde am Lehrstuhl für Botanik am Wissenschaftszentrum Weihenstephan der Technischen Universität München und in der Abteilung für Strukturforschung am Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried durchgeführt.

Zu allererst möchte ich mich bei Frau PD Dr. Christine Gietl bedanken, daß sie mir die Möglichkeit gegeben hat, diese interessanten Themen zu bearbeiten. Auch in der Folge hat sie mir jede nur erdenkliche Hilfe zukommen lassen und stand jederzeit mit Rat und Tat zur Seite. Anfänglich war die Beforschung der Ricinus CysEP und der drei KDEL-Peptidasen in Arabidopsis geplant. Als das Programm im Herbst 2003 abgearbeitet war, wurde zusätzlich die Reinigung und Charakterisierung der GPP übernommen. Diese Protease wurde bereits von einigen anderen Arbeitsgruppen aus dem Bereich der Peroxisomenforschung und seit 1997 auch von mehreren Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Gietl ohne Ergebnis gesucht.

In der Einarbeitungszeit standen mir Dr. Michael Meinhard, Dr. Alex Christmann und Dipl.Biol.Uwe Schuhmann bei labortechnischen, insbesonders molekularbiologischen Problemen mit Rat und Tat zur Seite. Das gilt auch für Dr. Axel Himmelbach, dem ich zusätzlich für die vielen gemeinsamen Trainingseinheiten auf dem Rennrad und den Langlauflatten danke. Ganz besonders hervorheben möchte ich den Feinmechanikermeister und Werkstattleiter Josef Reischenbeck, der mir bei technischen Problemen trotz ständiger Überlastung immer schnell und unbürokratisch weitergeholfen hat und meine Konstruktionspläne souverän und professionell umgesetzt hat. Dank gebührt Georg Hierl, der im Rahmen seiner Diplomarbeit die Analyse von KO-Mutanten in Arabidopsis für die potentielle Processing Peptidase übernommen hat und in letzter Minute noch einen wichtigen Befund beigesteuert hat.

Sehr dankbar bin ich den Gärtnerinnen Caroline Claus und Lisa Heldt für die bei der Aufzucht, Pflege und Aberntung der Pflanzen geleistete Syssiphus-Arbeit. Nicht zuletzt danke ich Prof. Dr. Wolfgang Höll, einem der Letzten, der über den Tellerrand hinausblickt, für die interessanten Gespräche und dem Ordinarius des Lehrstuhls für Botanik Prof. Dr. E. Grill für seine zahlreichen und stets hilfreichen Anregungen. Bedanken möchte ich mich auch bei den guten Geistern des Instituts, ohne die ein geregeltes Arbeiten nur sehr schwer möglich wäre: PD Dr. Klaus Lendzian, Beate Seeliger, Christoph HeidersberDanksagung ger und Christian Kornbauer.

Ein ganz besonderes Dankeschön geht an Prof. Dr. Robert Huber für die Einladung, in seiner Arbeitsgruppe (“Strukturfabrik”) am MPI in Martinsried die Kristallstruktur der Ricinus CysEP zu lösen (“Das wäre doch eine schöne Arbeit?!”) und den allgegenwärtigen Dr. Manuel Than, der mir durch seine außerordentlich engagierte und zeitintensive Betreuung den Einstieg in die Kristallographie ermöglicht hat. Begeistert hat mich die unglaublich kameradschaftliche Atmosphäre und die seltene Kombination von Kompetenz und Lässigkeit. In welcher Arbeitsgruppe trifft man am 21. Dezember um 3 Uhr nachts noch drei Kollegen für ein gemeinsames Bier? Hervorheben möchte ich, allerdings ohne Anspruch auf Vollständigkeit, folgende Mitarbeiter am MPI: Den phänomenalen Dr. Peter Sondermann (“Forschung braucht Zeit. Das kann man zum Teil dadurch kompensieren, daß man draufhält.”), meine Bench-Nachbarn Dipl.Chem. Katja Wenig und Dipl.Chem.

Stephan Henrich, Dipl.Biol. Martin “Gustl” Augustin, Dipl.Chem. Michael Koch (“Protein braucht Dreck!”), Dipl.Chem. Constanze Breithaupt (“Ich brauch keine Stereo-Brille, ich sehe das auch so.”), Dipl.Biotechnologe Tobias Krojer, Dr. Peter Göttig, Dipl.Chem. Werner Atzenhofer, Dipl.Chem. Michael Engel, “Zeugwart” Dipl.Chem. Rasso Willkomm, Snezan Marinkovic und nicht zuletzt die Proteasen-Legende Prof. Dr. Wolfram Bode.

Ein herzliches Dankeschön gilt der “2-D-Kapazität” Frau Prof. Dr. A. Görg vom Fachgebiet für Proteomik am Wissenschaftszentrum Weihenstephan der TU München, die uns trotz hoffnungsloser personeller Unterbesetzung durch Stellenstreichungen (“Der Prophet gilt nichts im eigenen Land.”) eine Kooperation im Rahmen des GPP-Projektes ermöglicht hat. Deshalb ein besonderes Dankeschön an den unermüdlichen Dipl.Biol. Carsten Lück, der mit mir in “Rambo-Manier” die Proteinreinigung über Sephadex-IEF und 2-D auf die Beine gestellt hat und Andreas Köpf, der uns etliche 2-D-Gele gefahren hat.

Ganz besonderer Dank gilt dem “Protein-Guru” Prof. Dr. Friedrich Lottspeich mit seiner Arbeitsgruppe für Proteinforschung am MPI in Martinsried, der uns aufgrund seiner enormen Erfahrung immer wieder wertvolle Ratschläge geben konnte und die zahlreichen, im Rahmen der Arbeit erforderlichen Sequenzierungarbeiten ermöglicht hat. In diesem Zusammenhang gebührt ein großes Lob Reinhard Mentele, der einen Großteil der Sequenzierungen durchgeführt und damit wesentlich zur Arbeit beigetragen hat.

Danksagung



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